Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
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Celulasas presentes en el tracto digestivo del
camarón Litopenaeus vannamei
Claudia Segovia-Salcedo
1
, Alexandra Narváez-Trujillo
2
, Fernando Espinoza-Fuentes
3
1
Departamento de Ciencias de la Vida. Escuela Politécnica del Ejército.
Sangolquí, Ecuador. mcsegovia@espe.edu.ec
2
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela de Ciencias Biológicas,
Ponticia Universidad Católica del Ecuador. Quito, Ecuador. anarvaez@puce.edu.ec
3
Universidad Espíritu Santo. Guayaquil, Ecuador.
Recibido: 2015-08-07; aceptado: 2015-10-12
RESUMEN.- Las celulasas han sido clasicadas como endoglucanasas responsables de degradar celulosa,
lo que le proporciona gran importancia en los procesos de la cadena alimentaria. Las celulasas y enzimas
relacionadas son utilizadas ampliamente en varios procesos industriales. La celulosa es utilizada como
una fuente nutricional por varios organismos, inicialmente se pensaba que únicamente microorganismos
podrían degradarla, pero en la actualidad se ha encontrado celulasas en varios grupos de animales. En este
trabajo, presentamos la detección de celulasas en extractos obtenidos del camarón Litopenaeus vannamei.
En los ensayos se utilizaron individuos adultos y de los diferentes subestadios de L. vannamei colectados
en los estanques de cría de las camaroneras de la Península de Santa Elena y Muisne, en las provincias
de Santa Elena y Esmeraldas, respectivamente. Los hepatopáncreas, los estadios larvarios y los intestinos
fueron homogeneizados en un homogeneizador Braun-Melsungen. Para la identicación de la celulasa,
se utilizó como sustrato carboximetil celulosa (CMC) de mediana viscosidad. Para medir su actividad se
añadió ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). La actividad de la celulasa se determinó en base en la cantidad
de los grupos reductores liberados. Para intentar determinar el origen sea endógeno o microbiano de las
celulasas identicadas, se sometieron las muestras de adultos a antibióticos.
En el subestadio zoea 3, se identicó una celulasa con un rango de pH óptimo entre pH 6.5 y pH 9.5. En las
muestras de hepatopáncreas del camarón adulto se determinaron dos pH óptimos: uno en el rango ácido (pH
4-6) y otro en el rango básico (pH 10-11) lo cual sugiere la presencia de dos celulasas diferentes. En el intestino
se observó actividad únicamente en el pH ácido (pH 4-6). La actividad celulolítica detectada en el desarrollo
ontogénetico del camarón fue baja e inestable, una condición reportada también en el análisis comparativo
de enzimas digestivas en otras cuatro especies de crustáceos. La actividad relativa de las dos enzimas del
hepatopáncreas es similar y cada una de estas tienen una actividad cuatro veces mayor a la encontrada en el
intestino. Estos resultados indican la presencia de dos celulasas presentes en el hepatopáncreas y se sugiere
que una de ellas (con pH óptimo ácido) podría ser transportada desde el hepatopáncreas al intestino, aunque
los datos no son concluyentes. En el caso de la celulasa con actividad a pH básico (10.5) puede tratarse de
una celulasa producida de manera endógena por el camarón. Los datos reportados en este estudio sobre las
capacidades de producción enzimática del camarón puede ser la base para futuros proyectos de investigación
cuyo objetivo sea optimizar los procedimientos de cultivo del camarón.
PALABRAS CLAVES: Celulasas, crustáceos, digestión, Ecuador, Litopenaeus vannamei.
ABSTRACT.- Cellulases have been classied as endoglucanases. This is the only enzyme capable of
degrading cellulose, which gives an immense importance in the processes of the food chain, being cellulose
the most abundant source of carbon on earth. Cellulases and related enzymes are widely used in various
industrial processes. Cellulose is used as a nutritional source for several organisms, initially it was thought
that only microorganisms may degrade this polymer however cellulases have been reported in many animal
groups. In this paper, we present the preliminary identication and characterization of cellulases in the shrimp
Litopenaeus vannameiduring its larval and adult stages. In adults and f different sub-stages of L. vannamei
were collected in culture tanks in comercial shrimp farms in the Santa Elena Peninsula and Muisne, in the
provinces of Esmeraldas and Santa Elena, respectively. The hepatopancreas, larval stages and intestines were
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anaeróbicos, producen complejos multienzimáticos
extracelulares que se encargan de la hidrólisis de la
celulosa (Ohara et al., 2000; Calderón-Cortés et al.,
2012; Tanimura et al., 2012; Tuyub-Tzuc et al., 2014).
Para intentar consensuar esta difícil actividad
la Internacional Union of Biochemistry and
Molecular Biology (1992) sugiere que la hidrólisis
de los complejos celulósicos empiezan a degradarse
por acción de las endoglucanasas que rompen
los enlaces 1,4-β-glucosídicos lo cual reduce
signicativamente el grado de polimerización de
la celulosa permitiendo que nuevos extremos de
cadenas queden expuestos y faciliten el acceso para
las exo-celobiasas que dan origen a unidades del
disacárido celobiosa, el cual será hidrolizado por la
enzima celobiasa originando moléculas unitarias
de glucosa (Hui et al., 2002).
La celulosa es utilizada como una fuente
nutricional por varios organismos, inicialmente
se pensaba que únicamente microorganismos
podrían degradarla pero en la actualidad se
ha encontrado celulasas en varios grupos de
animales. La tasa de absorción de nutrientes se
basa en la tasa del contacto de los nutrientes con
el epitelio intestinal. La inclusión de bra en la
dieta, como en el caso de celulosa, está asociada
con mayor tiempo de permanencia del alimento
en el estómago lo que contribuye a la utilización
eciente de proteína (Velurtas et al., 2011). De ahí,
que la formulación de cualquier dieta requiere de
una información detallada de los requerimientos
nutricionales y capacidades digestivas de las
especies. Los perles de actividad de las enzimas
digestivas han sido utilizados para determinar las
necesidades nutricionales de los crustáceos.
INTRODUCCIÓN
En los últimos 20 años el progreso en la ingeniería
genética de las enzimas y la tecnología de
fermentación, han permitido el desarrollo de
aplicaciones enzimáticas en las áreas industriales
que van desde la fabricación de detergentes más
ecientes y amigables con el ambiente, hasta
aplicaciones en la industria textil, del cuero, de
alimentos, cosméticos, productos médicos y
también como herramientas para proyectos de
investigación (Galante y Formantici, 2003). Esto ha
llevado a que el gasto en la utilización de enzimas
se cotice en varios millones de dólares a nivel
mundial y que los proyectos de investigación en
busca de nuevas enzimas aptas para ser utilizadas
en la industria se multipliquen (Beilen y Li, 2002).
Las celulasas han sido clasicadas en:
endoglucanasas, que se encargan de la destrucción
de los enlaces 1,4-β –glucosídicos actuando en la
hidrólisis en el interior de la cadena; luego están las
exo-celobiosas que son exoglucanasas, encargadas
de hidrolizar los enlaces 1,4- β- glucosidicos,
liberando celobiosa desde los extremos no
reducidos de la cadena de la celulosa; y celobiosas
conocidas también como β-glucosidasas, que
catalizan la hidrólisis del disacárido celobiosa
liberando a las glucosas (Henrissat, 1991; Lo Leggio
y Larsen, 2001; Byrne et al.,1999).
La hidrólisis de la celulosa se lleva a cabo de
diferente manera según la especie. En el caso de
algunos microorganismos aeróbicos se produce
una combinación de endo y exo- glucanasas,
que si bien atacan al sustrato individualmente
poseen una acción de sinergia entre ellas. Al
mismo tiempo se ha visto que algunos organismos
homogenized in a Braun-Melsungen homogenizer. Carboxymethyl cellulose (CMC) of medium viscosity was
used as a substrate. To measure enzymatic activity 3,5 dinitrosalicylic acid (DNS) was added. The cellulase
activity was determined based on the amount of reducing groups released. To try to determine the presence of
endogenous cellulases, that is produced by shrimp, samples were submitted to antibiotics and later assayed.
In sub-stage zoeal 3, a cellulase with an optimal pH range between pH 6.5 and pH 9.5 was determined.
In samples of adult shrimp hepatopancreas two optimum pH were determined: one in the acid range (pH
4-6) and one in the basic range (pH 10-11), while in the intestine only one in an acidic pH range (pH 4-6)
was determined. The cellulase activity detected in the ontogenetic development of the shrimp was low and
unstable, a condition also reported in the comparative analysis of digestive enzymes in four other species
of crustaceans. The relative activity of the two enzymes is similar in the hepatopancreas and each of these
have an activity four times greater than that found in the intestine. These results suggest the presence of two
possible cellulases, one could be transported from the hepatopancreas into the intestine but more tests are
needed to get more conclusive results. The cellulase activity at basic pH (10.5) may be a cellulase produced
endogenously by the shrimp. The data reported in this study of enzyme production capabilities shrimp can
be the basis for future research projects aimed at optimizing procedures shrimp farming.
KEYWORDS: Celullases, crustacean digestión, Ecuador, Litopenaeus vannamei
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
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intestinos y hepatopáncreas mediante una incisión
en la parte dorsal del animal. Dichas muestras
fueron transportadas a 4° C hasta el Laboratorio
de Biotecnología de la PUCE-Quito para los
análisis respectivos.
En el caso de los subestadios larvarios, estos fueron
recolectados en laboratorios de cría de camarón
en la provincia de Santa Elena. Los subestadios
colectados fueron: Zoea 1, 2 y 3; Mysis 1, 2 y 3; y pos-
larva 1, 2 y 6. Los subestadios se clasican según los
días desde la eclosión del nauplio (Fao, 2006), y con
esta base fueron clasicados por los laboratorios de
cría de camarón que proveyeron las muestras.
Preparación de los homogeneizados de
hepatopáncreas e intestinos.- El hepatopáncreas
fue homogeneizado con agua destilada a 4
grados centígrados en el laboratorio, se utilizó un
homogeneizador Braun-Melsungen de 5 mL de
capacidad con punta de teón. Para extraer la grasa
del hepatopáncreas se procedió a dos procesos
sucesivos de centrifugación (el primero a 12 000 rpm
por 20 min, seguido por 3 000 rpm durante 20 min)
mediante una centrífuga refrigerada Sorvall RC-5b
(Lee et al., 1990). La grasa fue desechada y se extrajo
el sobrenadante, llevándola a una concentración de
4 animales/mL. De igual manera, los intestinos
fueron homogeneizados (Ultra-Turvax T25) y
ltrados por una malla de nylon con un poro de 250
micras. La solución fue diluida hasta llegar a una
concentración nal de 6 animales/mL.
Preparación de los homogeneizados de los
subestadios.- Las muestras de los diferentes
subestadios de Litopenaeus vannamei se
homogeneizaron sobre hielo, en 16 mL de agua
destilada enfriada a 4° C, en un homogeneizador
Braun-Melsungen. Debido al reducido tamaño
de los animales en los diferentes subestadios
se homogenizó el animal completo (aprox. 400-
3 500 μm) (Rodgers et al., 2013). Los diferentes
homogeneizados se ltraron a través de una malla
de nailon con un poro de 250 micras. De esta
manera se obtuvo un preparado inicial, para cada
estadio, con una concentración de 40 a 50 animales/
mL, que se congeló a -20° C en alícuotas de 6 mL. El
homogeneizado inicial se diluyó hasta 5 veces según
la actividad enzimática en los diferentes estadios.
Cuanticación de proteína total.- La cuanticación
de proteína total en las muestras analizadas se la
realizó siguiendo el método de Bradford (1976), que
utiliza albúmina de huevo como muestra estándar
y métodos colorimétricos. Para preparar la proteína
patrón se disolvieron 6 mg de ovoalbúmina en 3
mL de agua destilada; esta solución de proteína
se diluyó diez veces. El colorante se preparó
Las enzimas celulasas se encuentran en una amplia
gama de invertebrados como anélidos, moluscos,
equinodermos y artrópodos (Crawford et al., 2004).
Se ha demostrado que algunos invertebrados
son capaces de degradar celulosa, celulasas
microbianas pueden estar contribuyendo a los
niveles de actividad enzimática observados en el
sistema digestivo (Nakashima et al., 2002). En la
última década se ha generado información sobre
la presencia de celulasas en invertebrados, aunque
en su mayoría atribuida a microorganismos
simbiontes presentes en los tractos digestivos.
Fueron Watanabe et al. (1998) quienes reportaron
por primera vez la producción de una celulasa
endógeno en Reticulitermes speratus Kolbe
(Isoptera: Rhinotermitidae) y posteriormente
ha habido otras investigaciones que han
reportado celulasas endógenas en los órdenes
Blattaria, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera,
Phthiraptera, and Orthoptera (Watanabe y
Tokuda, 2010). Una distinción importante es que
las celulasas endógenas de insectos se clasican
como endoglucanasas, la mayoría de la familia de
la glicosil hidrolasas 9 (GHF9), mientras que las
celulasas de origen microbiano reportadas son endo
y exo- glucanasas y corresponden a otras familias
de GHF (Watanabe y Tokuda, 2010). Actividad de
celulosas ha sido detectada en langostas, cangrejos
y cangrejos de río (Pavasovic et al., 2004). Directa
evidencia de una secreción endógena de celulasa
en un crustáceo ha sido demostrada gracias a
estudios moleculares en el cangrejo rojo (Cherax
quadricarinatus) y la presencia de una secuencia
de cDNA de endo-1-4-β-glucanasa que se reporta
en el hepatopáncreas de este artrópodo (Byrne et
al.,1999; Tanimura et al., 2012).
En este trabajo, presentamos la identicación y
caracterización preliminar de las celulasas del
camarón Litopenaeus vannameien sus estadios
larvario y adulto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de la muestra.- En los ensayos se
utilizaron camarones adultos y de los diferentes
subestadios de L. vannamei colectados en los
estanques de cría de las camaroneras de la Península
de Santa Elena y Muisne, en las provincias de Santa
Elena y Esmeraldas respectivamente.
En el caso de los adultos, se seleccionaron
especímenes con un promedio de 8.0 a 10.0 gramos
de peso corporal, con una curva de crecimiento
de 1.0 g/semana, que fueron alimentados con un
balanceado compuesto de 36 % de proteína.
En el lugar de recolección se extrajeron los
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30 g de tartarato de sodio y se aforó a 100 mL. La
actividad de la celulasa se determina en función de
la cantidad de los grupos reductores liberados, la
coloración será más intensa mientras mayor sea la
actividad hidrolítica, y por lo tanto la absorbancia
detectada por espectrofotometría será mayor
(Espinoza - Fuentes et al., 1984).
Una vez determinados los valores de pH en los
cuales la absorbancia era mayor y por lo tanto el pH
óptimo para la actividad hidrolítica de la enzima,
se procedió a cuanticar la actividad enzimática
relativa expresada en términos de mUnidades
(mU/animal). Una unidad de enzima es la
cantidad de enzima que hidroliza una nanomol de
sustrato por minuto.
La concentración de enzima presente en las
muestras ensayadas se obtuvo relacionando la
pendiente de cada ensayo con el factor de absorción
del sustrato, la cantidad de enzima utilizada en mL
y el factor de dilución de la muestra para obtener
la actividad enzimática relativa en mU/mL. Una
vez cuanticada la cantidad de proteína para cada
muestra de extracto, la actividad especíca (mU/
mg) se obtiene del cociente entre la actividad
relativa (mU/animal) y la concentración de proteína
total (mg/animal). Los ensayos de actividad
enzimática se realizaron en el pH determinando
para cada muestra y se utilizó CMC como sustrato,
tampón al pH óptimo y el extracto enzimático de
hepatopáncreas, intestino o del subestadio larvario.
Se utilizaron blancos de sustratos (sin extracto
enzimático) y de enzima (sin sustrato) a los cuales
se sometió al mismo tratamiento. Cada ensayo se
realizó por triplicado.
Actividad enzimática en camarones vivos adultos
en presencia de antibióticos.- Únicamente para
los camarones vivos adultos se realizaron ensayos
con (67) camarones vivos con un peso entre 8 y 10
g para eliminar la presencia de microorganismos
productores de celulasa. Los especímenes fueron
colectados y posteriormente transportados en
agua de mar para su cultivo en el Laboratorio de
Biotecnología de la Ponticia Universidad Católica
del Ecuador. Los camarones se mantuvieron en
peceras de 40 litros de agua con salinidad del 3 %,
a una temperatura de 22° C y aireación constante.
La alimentación usada fue balanceado comercial
con 36 % de proteína. En el tiempo cero del ensayo
se sacricaron dos especímenes y se cuanticó
la presencia de celulasa en el hepatopáncreas.
Para descartar o evidenciar la presencia de
crecimiento microbiano se sembraron muestras de
hepatopáncreas en agar nutriente, medio selectivo
para Pseudomonas, TCBS (medio selectivo para
Vibrio), Cetrimide (selectivo para Pseudomonas),
Caseina Peptina y Sauboraud 2 % de glucosa
disolviendo completamente 10 mg de azul de
Coomassie G en 5 mL de metanol, se añadieron 10
mL de ácido ortofosfórico (H
3
PO
4
) 85 % y se aforó a
100 mL con agua destilada. A cada tubo se le añadió
1 mL de colorante y después de 5 minutos se midió
la absorbancia contra un blanco de agua (100 μL)
sometido al mismo procedimiento anterior con
la utilización de un espectofotómetro Milton-Roy
Spectronic 301 (Absorbancia 595 nm).
Determinación del ph óptimo de celulasas y
cuanticación de la actividad enzimática.- En
el caso de los adultos y los subestadios previo
a la determinación de la actividad enzimática
se determinó el pH óptimo al cual la actividad
hidrolítica de la celulasa fue más evidente. Cada
ensayo se realizó en triplicado en un rango de pH
de 4.0 a 10.0, tomando intervalos de 0.5 unidades en
el caso de los subestadios y adultos, en este último
se amplió el rango básico hasta 11.0. Los valores de
pH en el rango de pH se lograron usando diferentes
tampones comunmente utilizados: citrato-fosfato
(pH 4.0-6.5), fosfato (pH 7.0-8.5) y glicina-NaOH
(pH 10.5-11). La concentración nal de los tampones
fue de 0.05 M (Espinoza-Fuentes et al., 1984).
Se utilizó como sustrato carboximetil-celulosa
(CMC) de mediana viscosidad con una concentración
nal de 0.5 %. Los tubos de reacción constaban, en
el caso de los adultos, de 0.2 mL de sustrato, 0.2
mL de tampón (0.2 M) a diferente pH (4.0-11.0) y
0.4 mL de extracto enzimático (hepatopáncreas
e intestino). En el caso de los subestadios, las
mezclas de reacción fueron de 0.5 ml de sustrato,
0.5 mL de tampón 0.2 M a diferente pH y 0.2 mL de
extracto enzimático (homogeneizado de camarón).
Los tubos fueron incubados en un baño maría a 30
grados centígrados por 30, 60, 90 y 120 minutos.
Para detener la reacción enzimática se adicionaron
0.4 ml de ácido 3.5 dinitrosalicílico (DNS), se agitó la
solución y se lo llevó inmediatamente a ebullición.
Los tubos fueron enfriados hasta temperatura
ambiente, se añadieron 0.4 mL de agua destilada en
el caso de los subestadios larvarios y 0.4 mL en el
caso de los adultos y se procedió a la cuanticación
por espectrofotometría. Para los ensayos se
establecieron muestras blancos en las cuales el
volumen correspondiente al extracto enzimático se
remplazó por el mismo volumen de agua destilada.
La absorbancia de las muestras se midió mediante
espectrofotometría a 540 nm contra una muestra
blanco de agua destilada sometida al mismo
tratamiento (Espinoza - Fuentes et al., 1984).
En la preparación del ácido 3-5 dinitro-salicílico
se disolvió 1 g de ácido 3-5 dinitro-salicílico en
20 mL de hidróxido de sodio (NaOH) 2 N; se
añadieron 50 mL de agua destilada para lograr una
buena disolución. Inmediatamente se añadieron
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
41
celulasa en los homogeneizados debido a un
comportamiento irregular de la enzima en los
ensayos en todos los estadios larvarios ensayados.
Para establecer la actividad en función del pH, se
eligió el estadio en el cual su actividad fue estable
y regular para la realización de los ensayos, en este
caso el subestadio zoea 3. En este subestadio se
determinó que el tiempo total de incubación óptimo
para cuanticar la actividad fue de 240 minutos en
cuatro intervalos de 60 minutos y se determinó un
rango amplio de pH - entre pH 6.5 y pH 9.5 - en
el cual se evidenció actividad celulásica (Figura 1).
pH óptimo de celulasas en hepatopáncreas e intestino.-
En las muestras de hepatopáncreas de camarón
adulto se determinaron dos pH óptimos: uno en
el rango ácido (pH 4-6) y otro en el rango básico
(pH 10-11), mientras que en el intestino se observó
únicamente el pH ácido (pH 4-6). (Figura 2).
Cuanticación de la actividad enzimática.- El
registro de absorbancia después de los intervalos
de incubación con las mezclas de reacción fue
irregular por lo cual, a pesar de tener evidencia de
(hongos) y se los evaluó. A todos los medios se les
adicionó 3 % de sal (NaCl).
Determinación de dosis de antimicrobianos.-
Para eliminar en lo posible a los microorganismos
presentes en el cultivo del camarón y que podrían
estar contribuyendo a la actividad de celulasa
identicada, se realizaron pruebas de sensibilidad
con las bacterias aisladas del hepatopáncreas. Los
antimicrobianos ensayados fueron: eritromicina (30
mg), ácido oxalínico (10 mg) nitrofurantoína (50
mg), cloranfenicol (50 mg), tetraciclina (30 mg) y
sulfatrimetroprim (25 mg). El nivel de sensibilidad
se basó en la medición de halos de inhibición de
crecimiento bacteriano alrededor del disco de
antibiograma bajo el método de Bauer-Kirby (1966).
A partir de los resultados de las pruebas de
sensibilidad, se realizó un control de supervivencia
con un individuo, al cual se le colocó en una pecera
con 50 ppm del antimicrobiano de mayor sensibilidad
y 1 mL/L de albendanzol (antiprotozoo). Se repitió
la dosis cada seis horas en el caso de los antibióticos
y una vez al día con el albendazol. Se sacricó
al individuo y se extrajo el hepatopáncreas para
comprobar el efecto de los antimicrobianos.
Posteriormente se realizó el mismo proceso con 20
camarones en un período de cinco días con la misma
frecuencia la frecuencia de administración de
antimicrobianos y albendazol para el control. Los
especímenes fueron sacricados, su hepatopáncreas
fue extraído y se llevó a una concentración nal
de 1.2 hepatopáncreas/mL (sin antibiótico) y 2.5
hepatopáncreas /mL (con antibiótico).
Este experimento se lo realizó nuevamente en
el laboratorio comercial AQUALAB S.A en la
península de Santa Elena con camarones adultos con
un promedio de 5 g con la nalidad de ensayar con
especímenes tratados previamente con probióticos
en las piscinas de crecimiento. Se utilizaron las
mismas concentraciones de antibióticos aplicadas
a los camarones en el Laboratorio de la PUCE. La
única diferencia fue el uso del quimioterapeútico
líquido Triuralin con dosis de 10 ppm, dos veces
al día en lugar de albendazol. Los hepatopáncreas
fueron extraídos y homogeneizados según los
procedimientos anteriores con una concentración
nal de 2.6 hepatopáncreas/mL (sin antibiótico) y
3.1 hepatopáncreas/mL (con antibiótico).
RESULTADOS
pH óptimo de celulasas en homogenizado de
subestadios larvarios.- Se tuvo dicultad en
determinar el pH óptimo de la actividad de
Figura 1. Curva de pH óptimo de la enzima celulasa en el
subestadio Zoea 3 del camarón Litopenaeus vannamei. La
actividad de la celulasa se presenta en un rango de pH de 6 a 9.5
Figura 2. Curva de pH óptimo de la enzima celulasa en el
hepatopáncreas e intestino del camarón adulto Litopenaeus
vannamei
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actividad de celulasa no se cuanticó la actividad
relativa de la celulasa en los estadios larvarios. El
subestadio en el cual se evidenció mayor estabilidad
de la actividad fue el subestadio zoea 3. En todos
los ensayos la actividad de la enzima fue baja.
Los datos de cuanticación de actividad enzimática
de las muestras en sus pH óptimos se reportan
en la tabla 1. La actividad relativa (mU/animal)
nos indica que la actividad de las dos especies
enzimáticas (pH 5 y pH 10)) en el hepatopáncreas
es similar, indicando que las dos podrían ser
producidas en este órgano; la actividad de la
especie enzimática del intestino es tres veces menor
a las del hepatopáncreas. Al determinar la actividad
en función de la cantidad de proteína presente
en la muestra (actividad especíca) se observa
una mayor actividad de la enzima en el intestino
que las dos presentes en el hepatopáncreas. Esto
sugiere que en el intestino la actividad detectada
podría ser la suma de la actividad de la enzima del
hepatopáncreas (pH 5) que viaja al intestino y la
actividad celulásica del aporte de microorganismos
asociados al intestino. Esta observación se respalda
por los ensayos realizados con el camarón cultivado
en el Laboratorio de Biotecnología de la PUCE
como en el laboratorio comercial en la Península
de Santa Elena, en los cuales la actividad especíca
de la celulasa es mayor en las muestras tratadas
con antimicrobianos con relación a las muestras
no tratadas, lo cual indica que sí hay un aporte de
parte de microorganismos asociados en cuanto a la
actividad de celulasa en el camarón.
Análisis microbianos.- Después de 24 horas
de cultivo se observó crecimiento bacteriano en
Agar nutriente, cetrimide, TCBS agar, y en el agar
selectivo para Pseudomonas. En los antibiogramas,
los antibióticos de mayor sensibilidad fueron
nitrofurantoína y ácido oxalínico.
DISCUSIÓN
La nutrición de los organismos marinos es esencial
para una acuacultura rentable, por lo cual los
tipos y las propiedades de las enzimas digestivas
del camarón denen las capacidades digestivas
y por tanto sugieren los ingredientes que deben
ser incluidos en las dietas para reproducir las
condiciones de la alimentación de los crustáceos en
condiciones naturales. Sin embargo, el proceso de
elaboración de dietas, en la mayoría de los casos,
no ha incluido información sobre las condiciones
siológicas y bioquímicas del camarón (Narváez-
Trujillo, 1990). Las especies de camarones son
omnívoros con amplias capacidades bioquímicas
para poder degradar las fuentes de energía de su
ambiente natural. El principal recurso energético
de este crustáceo es la proteína seguido por
los carbohidratos como energía metabólica.
Adicionalmente necesita lípidos como elementos
fundamentales en la función y estructura celular
(Gaxiola et al., 2006).
Los metazoos son capaces de digerir la celulosa
gracias a la presencia de microorganismos
simbiontes (bacterias, hongos y protozoos) que
proporcionan a sus hospederos habilidades
digestivas adicionales (Hood, 1971; Cutter y
Rosenberg, 1971; Mangrove, 1988; Byrne et al.,
1999). El modelo enzimático más conocido se
basa en el sistema de hongos donde se demuestra
su complejidad basada en acciones poligénicas,
conjuntos multienzimáticos y estructuras mixtas
formadas entre celulasas y proteínas, glicoproteínas
o polisacáridos (Eveleigh, 1987).
En el caso de crustáceos, el proceso digestivo se lleva
a cabo en el hepatopáncreas y en el intestino medio
con funciones y actividades diferentes en dichos
órganos. La celulasa actúa en la digestión primaria
Tabla 1. Actividad relativa (mU/animal) y especíca (mU/mg) de celulasas en las muestras de adulto analizadas*
*Se reporta la media de tres determinaciones.
MUESTRAS mU/Animal mU/mg
Muestras sin tratamiento
Hepatopáncreas (pH 5) 30.5±2.8 5.9
Hepatopáncreas (pH 10.5) 33.3±5.0 6.4
Intestino (pH 5) 8.3±0.6 8.9
Muestras tratadas en el Laboratorio de Biotecnología
Hepatopáncreas con tratamiento antimicrobiano 88.8±13.4 12.5
Hepatopáncreas sin tratamiento antimicrobiano 140.9±6.0 34.9
Muestras tratadas en las Camaroneras de Sta. Elena
Hepatopáncreas con tratamiento antimicrobiano 11.0±2.0 1.9
Hepatopáncreas sin tratamiento antimicrobiano 25.2±0.5 2.8
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
43
tratados con antimicrobianos, antifúngicos y
antiprotozoarios disminuyó en relación a las
muestras no tratadas (Tabla 1) apoyando la
hipótesis que la celulasa activa a pH ácidos (pH 4-6)
puede tener un origen fúngico o microbiano. Estos
resultados concuerdan con los datos de bacterias
aisladas del tracto digestivo de Penaeus aztecus que
describen a una o más celulasas junto con lipasas,
amilasas y quitinasas (Dempsey y Kitting, 1987).
Esta capacidad multienzimática sugiere un alto
potencial de degradación por parte de estas colonias
microbianas. Pero su funcionalidad va a estar
restringida a las condiciones ambientales del tracto
digestivo (pH, niveles de oxígeno, disponibilidad
de nutrientes (Tuyub-Tzuc et al., 2014).
En el caso de la celulasa con actividad a pH básico
(10.5) puede tratarse de una celulasa producida de
manera endógena por el camarón. Estos datos son
apoyados por lo encontrado por Byrne et al. (1999)
que identicó el cDNA de una endo-1,4-beta-
glucanasa de 469 aminoácidos, denominada CqEG,
generada en el hepatopáncreas del crustáceo Cherax
quadricarinatus. Este gen es similar en estructura a
los encontrados en los genes de endoglucanasas
funcionales de cucarachas y termitas (Watanabe y
Tokuda, 2001). Estudios de comparación genética
han identicado a estos genes pertenecientes a la
familia de glicosil hidrolasas (GFH) 9 celulasas
(Byrne et al., 1999) similares a los encontrados en
termitas lo cual sugiere un origen común entre las
células de insecto con la de crustáceos. Es posible
que las enzimas de celulasas hayan evolucionado
en diferentes linajes de los crustáceos en relación
con sus preferencias alimenticias principalmente
en los herbívoros (Crawford et al., 2004).
Las evidencias observadas en este estudio favorecen
la combinación de enzimas celulósicas endógenas
y simbióticas para la digestión de la pared celular
vegetal en L. vannamei. La participación cooperativa
de celulasas de diferentes fuentes (simbiontes
y hospederos) con diferentes características
enzimáticas proveen de un mecanismo exitoso de
digestión de dietas ricas en celulosa (Tanimura et al.,
2012). De igual manera debemos tomar en cuenta
que la composición de la ora bacteriana varía con
la dieta ya que un porcentaje de microorganismos
ingresan al tracto digestivo con la comida. De ahí,
la importancia de estudios más profundos sobre la
comunidad microbiana permanente y la itinerante
asociada al camarón y las capacidades enzimáticas
de cada una de ellas. Este estudio no descarta la
posibilidad que las fuentes de celulasas no sean
efectivamente de microorganismos resistentes a los
antimicrobianos utilizados.
iniciando su actividad en el hepatopáncreas para
posteriormente volver a activarse en el intestino
medio. En insectos se ha propuesto una recirculación
de enzimas que puede ser aplicado también a los
crustáceos (Espinoza-Fuentes et al., 1984)
La actividad celulolítica detectada en el desarrollo
ontogénetico del camarón fue baja e inestable,
una condición reportada también en el análisis
comparativo de enzimas digestivas en cuatro
especies de crustáceos incluyendo dos especies de
Penaeus realizada por Luqing (1997). A pesar de
evidenciar actividad celulolítica, la inestabilidad en
la actividad a lo largo del tiempo de desarrollo de los
ensayos y la baja actividad observada no permitió
cuanticar la actividad relativa. El pH óptimo
determinado en el rango de 6.5 a 9.5 sugiere que
puede haber una mezcla heterogénea de enzimas
por un origen múltiple de los extractos obtenidos
considerando que en los tanques de cultivo hay
larvas provenientes de nauplios desovados a partir
de diferentes hembras ovadas; por otro lado, este
amplio rango de pH observado puede indicar la
presencia de enzimas producidas por la larva y/o
por microorganismos asociados, a pesar del uso
y aplicación de antibióticos en los tanques de cría
(Narváez-Trujillo, 1990).
En el caso del adulto, se encontró actividad
enzimática para celulasas a dos pHs: 5.0 y 10.5 en el
hepatopáncreas y de pH 5.0 en el intestino (Segovia-
Salcedo, 1996). La actividad relativa (mU/animal)
de las dos enzimas del hepatopáncreas es similar
y cada una de estas tienen una actividad tres
veces mayor a la encontrada en el intestino. Estos
resultados sugieren la presencia de dos posibles
celulasas, una de ellas podría ser transportada
desde el hepatopáncreas al intestino. Los datos
de actividad de celulasa con un rango ácido
concuerdan con lo observado en estadio larvario
(Narváez-Trujillo, 1990). Una alternativa a esta
interpretación es que hay la producción de una
celulasa en el hepatopáncreas que tiene dos rangos
de pH para su actividad, en este caso aún se sostiene
la posibilidad que la enzima del hepatopáncreas se
movilice al intestino y actúe a un pH más ácido que
la del hepatopáncreas. En ninguno de los dos casos
se invalida la participación de actividad celulásica
por parte de microorganismos asociados como
sucede en otros crustáceos (Zimmer et al., 2002).
Celulasas de origen fúngico y microbiano presentan
actividad enzimática dentro de los rangos
encontrados en el intestino (pH 5) (Wang et al., 1994;
Guillén et al., 1987; Kaya et al., 1994; Copa-Patiño et
al., 1987; Espinoza-Fuentes et al., 1984; Tuyub-Tzuc
et al., 2014). Adicionalmente, la actividad enzimática
de los extractos provenientes de los organismos
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Los datos reportados en este estudio sobre
las capacidades de producción enzimática del
camarón pueden ser la base para futuros proyectos
de investigación cuyo objetivo sea optimizar
los procedimientos de cultivo de camarón. La
identicación de altos niveles de actividades
de carbohidrasas como las celulasas sugiere la
presencia de materiales vegetales en la dieta
de L. vannamei, lo cual está relacionado con la
presencia de algas como fuente alimenticia en estos
invertebrados ltradores. Estudios especícos
son necesarios para denir formulación de dietas
especícas para el camarón considerando tanto
la microbiota como las enzimas endógenas del
sistema digestivo. Futuras investigaciones en estas
áreas pueden reducir los costos de producción y
mejorar los niveles de digestión de las dietas.
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