Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
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Caracterización molecular de péptidos antimicrobianos a partir
de muestras de piel de Agalychnis spurrelli (Anura: Hylidae)
Andrea P. Vargas
1
, Óscar Pérez
2
, David Ortega - Paredes
2
, Myrian Rivera
1
1
Laboratorio de Investigaciones de Citogenética y Biomoléculas de Anbios (LICBA) ,
Ponticia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
2
Laboratorio de Biología del Desarrollo, Escuela de Ciencias Biológicas,
Ponticia Universidad Católica del Ecuador,, Quito, Ecuador. ap.vargash@gmail.com
Recibido: 2015-08-03; aceptado: 2015-08-27
RESUMEN.- Las secreciones de la piel de Agalychnis spurrelli han probado tener una marcada actividad
antimicrobiana sobre diferentes microrganismos patógenos por la presencia de biomoléculas en ellas. Se
realizaron análisis moleculares del ARN mensajero de la piel de A. spurrelli para determinar el tipo de
péptido antimicrobiano presente en las secreciones cutáneas de esta especie. Para amplicar las secuencias
precursoras de los péptidos maduros, se utilizaron iniciadores especícos que contienen secuencias
altamente conservadas. Como resultado se obtuvo una secuencia de ADN complementario de 357 pb,
la cual fue comparada con sus ortólogos de otras especies de la misma subfamilia Phyllomedusinae, se
lograron índices de identidad muy altos para precursores de dermaseptinas. Finalmente, para el análisis de
la secuencia de ADN complementario, se tradujo la secuencia nucleotídica por codones, con lo que se obtuvo
una secuencia aminoacídica. Dicha secuencia posee las características particulares de péptidos de la familia
de las dermaseptinas: una secuencia altamente conservada, una propieza acídica con los aminoácidos
Lisina y Arginina y el extremo C-terminal variable. En conclusión, la secreción total de Agalychnis spurrelli
contiene un péptido de la familia de las dermaseptinas o un péptido relacionado con ellas.
PALABRAS CLAVES: ADN complementario, Dermaseptinas, Phyllomedusinae, secuencias precursoras
ABSTRACT.- The skin secretions of Agalychnis spurrelli have proven to have a strong antimicrobial
activity on different pathogens because they contain certain biomolecules that have antimicrobial action.
In the Phyllomedusinae family antimicrobial peptides are commonly present. Molecular analysis where
performed in mRNA from the skin of A. spurrelli to determine the type of antimicrobial peptide present in
the skin secretions of this species. The precursor that amplies the sequences of mature peptides, where
amplied by using specic primers that contained the highly conserved sequence, characteristic in this
family. The result was a sequence of DNA complementary of 357 pb. This sequence was compared with their
orthologs from other species of the same subfamily Phyllomedusinae, obtaining very high levels of identity
for dermaseptin precursors. Finally, for the analysis of complementary DNA sequence, this was translated
into an amino acid sequence. This sequence has the characteristics of peptides of the dermaseptin family: a
highly conserved sequence, an acidic propiece with Lysine and Arginine and the variable the C-terminus.
In conclusion, the total secretions of Agalychnis spurrelli contain a peptide of the family of dermaseptin or a
dermaseptin like peptide.
KEYWORDS: complementary DNA, Dermaseptins, Phyllomedusinae, precursor sequences,.
nes medicinales y terapéuticos. Las biomoléculas
secretadas en la piel de los anbios constituyen
una fuente biológica de compuestos con varias
funciones siológicas, especialmente de defensa
(Barra y Simmaco, 1995), dirigida hacia patógenos
externos. Estas moléculas forman parte de la
inmunidad innata de estos organismos y pueden
ser aminas biogénicas, alcaloides complejos y
INTRODUCCIÓN
Por la cantidad de especies descritas a nivel
mundial, Ecuador está catalogado como el tercer
país en diversidad de anbios, y el primero en
el mundo por el número de especies por área
(Coloma et al., 2011). En el pasado, las comunidades
locales han utilizado muchas de estas especies con
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MATERIALES Y MÉTODOS
Para la caracterización con métodos moleculares
de péptidos antimicrobianos se siguió el protocolo
determinado por Vanhoye y colaboradores (2003).
Tres especímenes (SC26539, SC26542 y SC26543)
fueron sacricados colocándoles Lidocaina en el
área bucal para evitar dañar la piel. Posteriormente
se procedió a removerla para obtener varias
muestras de aproximadamente 180 mg que fueron
conservadas y almacenadas en RNAlater (QIAGEN
Cat.No. 76106) a -20º C según lo especica el
protocolo de clonación de Vanhoye et al. (2003).
Consecutivamente se extrajo el ARN total. Se utilizó
el reactivo Tri Reagent (MOLECULAR RESEARCH
CENTER INC. Cat. No. TR-118), el protocolo se
siguió según las especicaciones del fabricante
mediante la centrífuga Refrigerated Centrifuge
SIGMA 1-15K. El ARN resultante se disolvió en 25
μl de agua DEPC. Para comprobar la presencia de
ácidos nucleicos se corrió el ARN extraído en geles
de agarosa al 1 % y TBE 0.5X.
Después, el ADN complementario (ADNc) fue
sintetizado a partir del ARN total extraído de las
muestras de piel. Para esto se utilizó la transcriptasa
reversa M-MulV (ROCHE Cat .No.11062603001) así
como el protocolo especicado por el fabricante con
los siguientes reactivos: 5 μl de buffer de incubación
5X, 1.25 μl de M-MulV transcriptasa reversa, 2.5 μl
de PolyA oligodT (ROCHE Cat. No. 10108677001),
1 μl de Inhibidor de RNAsas (ROCHE Cat. No.
03335399001), 1.25 μl de deoxinucleotidos trifosfato
(dNTPs) (INVITROGEN Cat. No. 1842701), 5 μl de
templado de ARN total (2-5 μg) y 9 μl de agua libre
de nucleasas (DEPC).
Al producto de la reacción se lo colocó en un tubo
de microcentrífuga de 1.5 ml con un volumen nal
de 25 μl y posteriormente fue incubado en un baño
María Reciprocal Shaking “Bath PRECISION”,
por una hora a una temperatura de 37º C. A partir
del ADNc sintetizado se realizó un protocolo de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con el
objetivo de amplicar una porción de la secuencia
del precursor del péptido de A. spurrelli del ADN
complementario total obtenido.
Para realizar la amplicación se diseñaron
iniciadores especícos basándose en secuencias
conocidas de precursores de dermaseptinas
encontrados en especies cercanas a A. spurrelli
como Agalychnis callidryas y Agalychnis annae.
Para esto, dos secuencias de precursores de A.
callidryas y una de A. annae fueron alineadas entre
sí. Dichas secuencias fueron alineadas mediante el
programa ClustalW de European Bioinformatics
Institute EMBL. Una vez encontradas las porciones
péptidos antimicrobianos (Simmaco et al., 1998).
Para que la inmunidad innata, pueda actuar sobre
patógenos que evolucionan rápidamente, los genes
del sistema inmune de los anbios poseen niveles
muy altos de polimorsmos, dados por la presión
selectiva. Este polimorsmo está asociado con
la actividad antimicrobiana dada por los genes
implicados. Ranas que pertenecen al mismo género
pero de diferentes especies o subfamilias, pueden
tener diferentes tipos de péptidos con diferente
tamaño, carga, hidrofobicidad, conformación y
espectro de acción (Duda et al., 2002).
En los anbios ecuatorianos la familia Hylidae es
una de las más extensas por contener alrededor de
51 géneros incluidos en tres subfamilias: Hylinae,
Pelodryadinae y Phyllomedusinae. De la subfamilia
Phyllomedusinae han podido ser aislados
aproximadamente 80 péptidos antimicrobianos
que, agrupados por alineamiento múltiple de sus
secuencias, forman 7 familias de péptidos: las
phylloseptinas (PLS), las dermatoxinas (DRT),
las plasticinas (PTC), las phyllotoxinas (PLX), las
hyposinas (HPS), los péptidos huérfanos y las
dermaseptinas (DRS) (Amiche et al., 2008).
Las Dermaseptinas están representadas por 50
péptidos provenientes de los géneros Pachymedusa,
Phyllomedusa y Agalychnis (Amiche et al., 2008). Son
lineares, catiónicos y generalmente no hemolíticos
(De Lucca et al., 1998). La naturaleza anpática de
las dermaseptinas les permite una interacción con la
membrana del patógeno causando un colapso total de
la integridad de la misma, dando como resultado la
pérdida de la permeabilidad (Charpentier et al., 1998).
Para la mayoría de las dermaseptinas los
precursores codican una sola copia del péptido
antimicrobiano maduro al extremo C-terminal de
la secuencia. Una comparación de las secuencias
precursoras de los péptidos revela que poseen
una preproregión N-terminal común, altamente
conservada inter e intraespecícamente y una
región C-terminal diferente que corresponde
a los péptidos antimicrobianos maduros. La
preprorregión conservada comprende una señal
peptídica hidrofóbica de 22 residuos seguidos
por una propieza acídica que termina en una
prohormona que procesa la señal Lisina Arginina
(Lys-Arg) (Duda et al., 2002).
Por lo antes expuesto, en la presente investigación se
realizaron análisis moleculares del ARN mensajero
de la piel de Agalychnis spurrelli para determinar
la presencia de un péptido antimicrobiano en las
secreciones cutáneas de esta especie, las mismas
que han probado tener una amplia actividad
antimicrobiana (Cilveti et al., 2013), antifúngica
(Vargas, 2012) y anticancerígena (Chuang, 2012).
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
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de poliA presente en el ARN como sitio de inicio
para PCR. Para este procedimiento se utilizó el
ARN total extraído de la piel de la rana empleando
como iniciadores especícos al iniciador corriente
arriba A.spuF1 basado en el dominio altamente
conservado del extremo N-terminal de los péptidos
antimicrobianos de la familia Hylidae. Los
iniciadores especícos corriente abajo AP y AUAP
fueron obtenidos del Kit de reacción del 3’RACE
(System for Rapid Amplication of cDNA Ends
INIVTROGEN Cat. No. 18373-019).
Para la síntesis de ADN complementario se procedió
según las especicaciones del fabricante utilizando
de 1 a 5 μl del ARN total extraído de la piel de A.
spurrelli y un ARN control incluido, en el Kit.
Para la amplicación del ADNc de interés se
siguieron las especicaciones del Kit (3’RACE
System for Rapid Amplication of cDNA Ends
INVITROGEN Cat. No. 18373-019).
La termocicladora fue programada con los siguientes
ciclos: Desnaturalización inicial a 94º C por 3
minutos, desnaturalización a 94º C por un minuto,
acoplamiento a 56º C por un minuto, extensión a
72º C por 3 minutos con 30 segundos y extensión
nal a 72º C por 5 minutos. Los ciclos 2, 3 y 4 se
repitieron por 35 veces según las recomendaciones
del fabricante de la GoTaq polimerasa y el protocolo
de 3’RACE. Luego de la amplicación se extrajo la
muestra con 50 μl de cloroformo y se transrió la
fase acuosa en un tubo nuevo.
Al término del PCR, todas las muestras resultantes
fueron corridas en geles de agarosa y visualizadas, las
bandas del tamaño adecuado fueron extraídas del gel.
más alineadas se utilizó el programa BCM
Searchlauncher de Baylor Collage of Medicine
HGSC para diseñar los iniciadores corriente abajo
A.spuR1 y A.spuR2, los cuales fueron iniciadores
degenerados. (Tabla 1)
El iniciador corriente arriba A.spuF1 pertenece
a la secuencia nucleotídica que codica para
el extremo N-terminal de la preprorregión de
los precursores de dermaseptina diseñado por
Vanhoye et al. (2003). La síntesis de los iniciadores
fue realizada bajo pedido por INVITROGEN.
Una vez obtenidos los iniciadores A.spuF1,
A.spuR1 y A.spuR2 se realizó un PCR anidado.
Este procedimiento utilizó una ADN polimerasa
GoTaq (PROMEGA Cat. No. M3005) siguiendo el
protocolo recomendado por el fabricante.
Para la elaboración de estas amplicaciones
se utilizó una termocicladora PTC-100 MJ
RESEARCH. La reacción se colocó en la
termocicladora, la cual se programó con los
siguientes ciclos: desnaturalización inicial a 94° C
por 2 minutos, acoplamiento a 56° C (temperatura
dependiente de la secuencia de los iniciadores
empleados) por un minuto, extensión a 72° C por 3
minutos con 30 segundos y extensión nal a 72° C
por 5 minutos. Los ciclos 2, 3 y 4 se repitieron por
33 veces según las recomendaciones del fabricante
de la polimerasa. La temperatura de acoplamiento
se obtuvo mediante la ecuación de Wallace. Al
término del PCR todas las muestras resultantes
fueron corridas en geles de agarosa y visualizadas.
Las bandas del tamaño adecuado fueron extraídas
del gel de agarosa para realizar la Amplicación
Rápida De Extremos 3’ De ADN Complementario
(3’RACE). Se realizó el 3’RACE usando la cola
Tabla 1. Iniciadores utilizados en la caracterización de péptidos antimicrobianos de la piel de A. spurrelli. De arriba hacia abajo: Tres iniciadores
degenerados diseñados a partir de secuencias conocidas de precursores de péptidos antimicrobianos; tres iniciadores en el Kit de 3’ RACE AP,
AUP, AUAP; y tres iniciadores incluidos en el Kit de clonación pCR 2.1 TOPO M13 Reverse, M13 Forward y T7 Promoter.
Primers Secuencia Referencia
Primer degenerado A.spuF1 5’-GGC TTT CCT KAA GAA ATC TC-3’
Primer degenerado A.spuR1 5’-CCT CYT CAT CTT CAT TTT CTC-3’
Primer degenerado A.spuR2 5’-CAC TTT GCT CRT CRT CTT CTT G-3’
3’ RACE Adapter Primer 5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT
TTT TTT TTT TTT T-3’
AP primer INVITROGEN
3’RACE Universal Amplication Primer 5’-CAU CAU CAU CAU GAC CGT TCA
GCT GGA TAT TAC-3’
UAP primer INVITROGEN
3’ RACE Abridged Universal
Amplication Primer
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’ AUAP primer INVITROGEN
M13 Reverse Primer 5’-CAG GAA ACA GCT ATC AC GTC CTT
TGT CGA TAC TG-3’
pCR 2.1 TOPO
T7 Promoter 5’-AGT GAG TGC TAT TA TCA CTC AGC
ATA AT-3’
pCR 2.1 TOPO
M13 Forward(-20)Primer 3’-CTG GCC GTC GTT TTA C GAC CGG
CAG CAA AAT G-5’
pCR 2.1 TOPO
REMCB 36 (2), 2015
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RESULTADOS
Como resultado de la amplicación del ADN
complementario de A. spurrelli con los iniciadores
especícos diseñados a partir de secuencias
conocidas de precursores peptídicos, se obtuvo
un gel de agarosa con varias bandas. Se pudieron
observar dos bandas de aproximadamente
100 y 120 pb amplicada con los iniciadores
A.spuF1-A.spuR1 y A.spuF1-A.spuR2. También se
observó una banda de 357 pb aproximadamente,
correspondiente a la amplicación de la secuencia
total de interés, obtenida del 3’RACE con los
iniciadores A. spuF1-AUAP (3’RACE). (Figura 1).
De la clonación de las secuencias A.spuF1-A.spuR1,
A.spuF1-A.spuR2 y A.spuF1-UAP (3’RACE)
en bacterias competentes, se obtuvieron varias
colonias transformadas con el inserto en la placa de
cultivo. A continuación se seleccionó una colonia
para realizar una amplicación con los iniciadores
A. spuF1 y AUAP. Como resultado, en el gel de
agarosa al 1 %, pudieron observarse bandas de 357
pb aproximadamente, que corresponden al tamaño
esperado de la secuencia total del precursor
de los péptidos antimicrobianos. Se realizó el
mismo procedimiento con A.spuF1-A.spuR1 y
A.spuF1-A.spuR2. Finalmente se seleccionaron
tres colonias de cada inserto para ser puricadas y
posteriormente secuenciadas. Como resultado de la
puricación del plásmido y su posterior secuenciación
se obtuvo la secuencia precursora del péptido de
Agalychnis spurrelli que cuenta con 357 pb (Figura 2)
y dos amplicones más pequeños que pertenecían a la
amplicación de segmentos de la secuencia precursora
de 100 y 120 pb.
Los fragmentos de A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.
spuR2 y A.spuF1-AUAP (3’RACE) se ligaron al
vector pGEM®-T Vector System (PROMEGA Cat.
No. A3610), por poseer una región de resistencia
a la ampicilina y alfa complementación. El
protocolo fue realizado según las especicaciones
del fabricante. Las bacterias competentes se
transformaron con los vectores que contenían los
fragmentos A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.spuR2
y 3’RACE. Para esta transformación se utilizaron
las bacterias químicamente competentes One
ShotR TOP10 Competent Cells INVITROGEN
(Cat. No. C40401). El protocolo se realizó según las
especicaciones del fabricante. Simultáneamente
a este protocolo se preparó el medio de cultivo
bacteriano. Para esto se usó el medio Luria-Bertoni
(LB) y Agar en 2 cajas Petri plásticas para cada
fragmento. Una vez polimerizado el medio, se
sembraron 30 μl de X-Gal INVITROGEN (Cat. No.
15520018) a un concentración de 40 mg/ml, y 15
μl de ampicilina ROCHE (Cat. No. 10835242001) a
una concentración de 50 mg/ml para cada placa.
Posteriormente a su transformación, las bacterias
fueron sembradas en el medio de cultivo
previamente preparado. Pasadas las 24 horas se
observó el crecimiento de colonias, y se marcó
con un círculo a las colonias recombinadas con
cada amplicón. Con el objetivo de conocer si las
colonias crecidas en las cajas Petri contenían el
inserto, se realizó un PCR de cada cultivo de
colonias, mediante iniciadores especícos del
vector A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.spuR2
y A. spuF1-AUAP (3’RACE), con su respectiva
temperatura de acoplamiento. Se escogieron tres
colonias de A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.spuR2
y 3’RACE. A continuación se puricó el plásmido
con el inserto de las colonias escogidas. Para este
procedimiento se utilizó el kit High Pure Plasmid
Isolation para preparaciones mini (ROCHE Cat.
No. 11754777001). El Kit fue utilizado según las
especicaciones del fabricante. Las muestras
se enviaron a secuenciar con los iniciadores T7
corriente arriba y SP6 corriente abajo, especícos
del vector. Las muestras fueron secuenciadas por el
servicio de secuenciación MACROGEN Inc.
Para un análisis más profundo se realizó la traducción
de las secuencias nucleotídicas empleando el
programa BCM Search launcher de Baylor Collage of
Medicine HGSC. Se obtuvieron 6 marcos de lectura,
tres en sentido 5’3’ y tres en sentido 3’5’. Cada
secuencia obtenida fue alineada con las secuencias
aminoácidicas de péptidos antimicrobianos y de las
especies más cercanas, seleccionando la secuencia
mejor alineada usando el programa ClustalW del
European Bioinformatics Institute EMBL, que indicó
el índice de identidad entre ellas.
Figura 1. Amplicones A.spuF1 con A.spuR1, A.spuR2 y AUAP
(3’RACE). De izquierda a derecha se puede observar: M, la
escalera de peso molecular (Ladder); 1 y 2, secuencias de 357pb
precursoras de dermaseptinas producto de 3’RACE; 3, amplicón
de 120pb obtenido del PCR anidado con A.spuF1 y A.spuR1; 4,
amplicón de 100pb obtenido del PCR anidado con A.spuF1 y
A.spuR2; 5, control negativo; 6, control positivo (3’RACE).
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
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A continuación se procedió a comparar la secuencia
precursora total de péptidos antimicrobianos de A.
spurrelli con secuencias del banco genético National
Center of Biotechnology Information (NCBI). Los
índices de identidad obtenidos muestran que la
secuencia precursora del péptido de Agalychnis
spurrelli se encuentra estrechamente relacionada
con secuencias precursoras de dermaseptinas y
péptidos relacionados con dermaseptinas, aisladas
Figura 2. Amplicón de A.spuF1-AUAP a partir de colonias
transformadas. Los amplicones de ADN fueron obtenidos
a partir de la amplicación de colonias recombinadas,
amplicadas con iniciadores A.spuF1-AUAP. De izquierda a
derecha se observan la escalera de peso molecular seguida de
las bandas uno y dos de 357pb.
de las especies Agalychnis annae, Agalychnis
callydrias, Phyllomedusa sauvagei y Phyllomedusa
hypochondrialis. (Tabla 2).
DISCUSIÓN
El ADN contiene empacada toda la información
genética que un organismo necesita para
desarrollarse y funcionar, y en base a esa información
este puede construir proteínas (Watson et al., 2007).
El ARN mensajero contiene la información genética
procedente del ADN para la síntesis de proteínas.
Estas a su vez son los productos nales de la mayoría
de rutas de información y tienen que ser sintetizadas
y transportadas en respuesta a las necesidades
celulares del momento (Lehninger et al., 2008).
La información de los precursores de péptidos
antimicrobianos presentes en la piel de los anbios,
está codicada en el ADN de cada una de las células
del organismo. Sin embargo, estas secuencias son
traducidas exclusivamente en las células de la
piel para la producción de sustancias de defensa
secretadas por las glándulas granulares (Tennessen
y Blouin, 2008). Las secuencias de estos péptidos son
muy similares entre especies relacionadas. (Figura 3).
Los anbios de la familia Hylidae poseen
precursores llamados preprodermaseptinas
(Vanhoye et al., 2003) a partir de las cuales fueron
diseñados los iniciadores A.spuF1 corriente arriba,
A.spuR1 y A.spuR2 corriente abajo. Es posible
encontrar ciertos segmentos de la secuencia de una
proteína en organismos de un grupo taxonómico
y no en otros grupos y estos segmentos pueden
usarse como “secuencia rma” del grupo en el cual
se encuentren (Lehninger et al., 2008).
Tabla 2. Índices de identidad de la secuencia A.spuF1-AUAP (3’RACE) de Agalychnis spurrelli comparados con las secuencias de sus
ortólogos en otras especies.
ESPECIE TIPO DE SECUENCIA IDENTIDAD MÁXIMA
Agalychnis annae mRNA for dermaseptine related peptide, clone AA 3-1 96%
Agalychnis callidryas mRNA for DRP-AC1 precursor (drp.AC1 gene) 89%
Phyllomedusa hypocondralis mRNA for dermaseptine H2 protein precursor (dsn-2 gene) 87%
Phyllomedusa hypocondralis mRNA for dermaseptine H1 protein precursor (dsn-1 gene) 87%
Agalychnis callidryas Dermaseptien like precursor DRP-AC-3 mRNA 90%
Phyllomedusa sauvagei mRNA for preprodermaseptine S13 (drsS13 gene) 83%
Phyllomedusa sauvagei Partial mRNA for preprodermaseptine S12 (drs12 gene) 83%
Phyllomedusa sauvagei mRNA for dermaseptin sVII 86%
Agalychnis annae mRNA for dermaseptin-related peptide, clone AA-3-6 81%
Phyllomedusa hypocondralis mRNA for preprodermaseptine H3 (dpp-H3 gene) 89%
Agalychnis callidryas mRNA for ARP-AC1 precursor 80%
Phyllomedusa hypocondralis mRNA for preprodermaseptine H4 91%
Phyllomedusa sauvagei mRNA preprodermaseptine S11 (drsS11 gene) 79%
REMCB 36 (2), 2015
62
presente en el mensajero de A. spurrelli. El alto
grado de conservación de estas preprorregiones se
debe a que se originó de una familia de multigenes
perteneciente a un ancestro común (Duda et al., 2002).
Sin embargo, a pesar de tener una preprorregión
altamente conservada evolutivamente, los péptidos
antimicrobianos poseen un extremo C-terminal
muy variable. Esta variabilidad da como resultado
una gran cantidad de péptidos de diferentes
tamaños, secuencias y espectro antimicrobiológico
(Vanhoye et al., 2003); no obstante, muchas de
estas sustituciones de aminoácidos observadas
en una familia de proteínas pueden ser de tipo
conservador, es decir, sustituciones en las cuales
un residuo de un aminoácido está remplazado por
otro que posee propiedades químicas similares
(Lehninger et al., 2008).
Para conocer el tamaño y la secuencia total del
precursor del péptido antimicrobiano de A. spurrelli
se realizó la técnica molecular llamada 3’RACE
(Rapid Amplication of cDNA Ends).
Esta técnica amplica secuencias nucleotídicas a
partir de un ARN mensajero usado como templado.
El 3’RACE necesita dos secuencias iniciadoras
especícas que encierren a la secuencia de interés
y toma ventaja de la cola de poliA contenida en
al ARNm como iniciador genérico para sintetizar
ADN complementario (Sambrook y Russell, 2001).
En el caso de A. spurrelli se tomó como iniciadores
a la preprorregión altamente conservada con el
iniciador A.spuF1 especíco y el iniciador AUAP
genérico que se une a la región conocida en el
extremo 5’ (Figura 4). Como resultado se obtuvo
una secuencia de 357 pb, consistente con la longitud
de los precursores de péptidos antimicrobianos de
la familia Hylidae (Vanhoye et al., 2003).
La amplicación de una porción pequeña del
precursor a partir de estos iniciadores indica que
el dominio altamente conservado de péptidos
antimicrobianos de la familia Hylidae, está
Figura 3. Alineamiento de secuencias precursoras de péptidos
antimicrobianos de especies de la subfamilia Phyllomedusinae.
Identidades nucleotídicas coloreadas, alineadas con el editor de
alineamientos Bioedit.
Figura 4. Esquema de la región amplicada y clonada usando métodos moleculares. En azul se observan la prepro-región altamente conservada
de precursores de péptidos antimicrobianos usada como iniciador corriente arriba (A.spF1) y el iniciador de amplicación universal AUAP
corriente abajo. En verde se observa la secuencia amplicada del precursor de péptidos antimicrobianos de A. spurrelli con 357 pares de base.
Este fragmento y sus iniciadores se encuentran en el dominio lacZ- (3.9 kb) del vector de clonación pCR 2.0-TOPO.
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
63
El alto índice de identidad que se obtuvo mediante
la comparación y alineamiento de la secuencia
resultante, con las secuencias precursoras de
péptidos antimicrobianos presentes en el Banco
Génico, NCBI, demostró que el extracto crudo de
A. spurrelli contiene una dermaseptina o un péptido
relacionado con las dermaseptinas. Se puede
asegurar que se trata de una dermaseptina, por el
alto grado de similitud de secuencias ortólogas con
otras especies de la familia Hylidae como Agalychnis
annae (mRNA for dermaseptin-related peptide,
clone AA-3-1) con 96 %, Agalychnis callidryas (mRNA
for DRP-AC1 precursor (drp-AC1 gene) con 89 %,
Phyllomedusa hypochondrialis (mRNA for dermaseptin
H1 y H2 protein precursor) con 87 % y Phyllomedusa
sauvagei (mRNA for preprodermaseptin S 12 y S13)
con un 83 % de similitud (Tabla 3).
Posterior al análisis de las secuencias de ADN
complementario se procedió a traducir las
secuencias aminoacídicas, se obtuvo como
resultado seis marcos de lectura, los cuales fueron
alineados con secuencias ortólogas presentes
en el Banco Génico NCBI. Todos los marcos de
lectura tuvieron índices de identidad altos. Esto
podría indicar una estrecha relación en el origen
de los péptidos antimicrobianos o incluso un
origen común de los mismos. El marco de lectura
3’5’ Frame 1, obtuvo la similaridad más alta con
Agalychnis annae con un 90 %. Mientras que con las
otras especies antes mencionada uctúa entre 86 %
y 46 %, lo cual podría suponer una estrecha relación
en el origen de los péptidos antimicrobianos de
ambas especies (Figura 5).
Adicionalmente, la secuencia aminoacídica de A.
spurrrelli presenta la región altamente conservada
de péptidos de la familia Hylidae, una propieza
acídica que mantiene el extremo Arginina-
Lisina, y la región N-terminal de precursores de
dermaseptinas (Vanhoye et al., 2003).
Mediante la comparación de las secuencias
nucleotídicas y aminoacídicas de A. spurrelli con los
secuencias presentes en el banco génico NCBI, se
obtuvieron índices de identidad que nos indican que
estos amplicones, y las secuencias aminoacídicas,
poseen un alto grado de similaridad con secuencias
ortólogas de A. annae.
La diversicación de los loci pudo haber sido parte
de una estrategia evolutiva desarrollada por estas
especies como resultado de cambios del nicho
ecológico, tomando en cuenta el dramático cambio
evolutivo de predadores microbianos (Duda et al.,
2002). El uso de una familia de proteínas para realizar
estudios evolutivos y de relaciones logenéticas
requiere de la identicación de miembros de esta
familia con funciones similares en la gama más
amplia posible de organismos. La información
Tabla 3. Índices de identidad de la secuencia aminoaminoacídica traducida a partir de A.spuF1-AUAP (3’RACE) de Agalychnis
spurrelli comparados con las secuencias de sus ortólogos en otras especies
Especie Tipo De Secuencia Identidad Máxima
Agalychnis annae mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-1 58%
Phyllomedusa hypocondrialis mRNA for dermaseptine H1 protein precursor (dsn-1 gene) 45%
Agalychnis callydrias Dermaseptine-like precursor DRP-AC-3 41%
Phyllomedusa hypocondrialis mRNA for dermaseptin H2 protein precursor (dsn-2 gene) 45%
Agalychnis callydrias mRNA for DRP-AC-1 precursor 41%
Phyllomedusa sauvagei mRNA for preprodermaseptin S12 (drsS1 gene) 44%
Phyllomedusa sauvagei Partial mRNA for preprodermaseptin S13 (drsS1 gene) 46%
Agalychnis callydrias mRNA for ARP-AC-1 precursor 43%
Agalychnis annae mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-3 38%
Agalychnis annae mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-4 30%
Agalychnis callidryas mRNA for ARP-AC1 precursor 90%
Phyllomedusa hypocondrialis mRNA for phyllosepti-8 protein precursor 86%
Phyllomedusa sauvagei mRNA preprodermaseptin S9 (drsS9 gene) 86%
Figura 5. Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la
secuencia precursora de péptidos de Agalychnis spurrelli.
Secuencia de 75 aminoácidos amplicada a partir de A.spuF1-
AUAP. La secuencia nucleotídica se encuentra subrayada.
REMCB 36 (2), 2015
64
Citogenética y Biomoléculas de Anbios (LICBA),
de la Escuela de Ciencias Biológicas de la PUCE
por su constante colaboración. A la Ponticia
Universidad Católica del Ecuador por el apoyo
nanciero otorgado al proyecto: Caracterización
química y citogenética de anbios ecuatorianos.
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Lehninger AL, Nelson DL, Cox M. 2008. Principles of
Biochemistry. W.H. Freeman. New York, USA.
extraída de la familia de proteínas puede usarse
para el análisis de divergencia y relación evolutiva.
Sin embargo, esta información debe ser comparada
con investigaciones sobre siología y bioquímica
de los organismos (Lehninger et al., 2008).
No obstante, la información obtenida a partir de la
secuencia precursora de péptidos antimicrobianos
de A. spurrelli ha servido, en este estudio, para la
preliminar identicación de uno de los péptidos
antimicrobianos presente en las secreciones de la
piel de dicho organismo.
CONCLUSIONES
•La secuencia nucleotídica precursora de péptidos
antimicrobianos presente en Agalychnis spurrelli,
pertenece a los precursores de antimicrobianos
de la subfamilia Phyllomedusinae, ya que
fue amplicada con las regiones altamente
conservadas características de este grupo
taxonómico.
•Gracias al alto grado de conservación de
las secuencias nucleotídicas precursoras de
péptidos antimicrobianos de la subfamilia
Phyllomedusinae, estas pudieron ser
adecuadamente usadas como iniciadores
para la caracterización molecular de péptidos
antimicrobianos relacionados.
•La secuencia precursora de Agalychnis spurrelli
posee un alto grado de identidad con su
ortólogo en la especie Agalychnis annae, por
lo cual puede inferirse una historia evolutiva
muy cercana de estas especies por presiones de
evolución adaptativa.
•La secuencia aminoacídica del péptido
antimicrobiano obtenida de Agalychnis spurrelli y
las de sus ortólogos Agalychnis annae, Agalychnis
callidryas, Phyllomedusa hypochondrialis y
Phyllomedusa sauvagei, posee una región altamente
conservada, una propieza acídica que exhibe el
extremo Arginina-Lisina, y una región C-terminal
multivariable, regiones que son características de
los precursores de dermaseptinas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su imperecedero
agradecimiento a la Dra. Iliana Alcocer Negrete del
Laboratorio de Microbiología de la PUCE y a la Dra.
Jeannete Zurita, de Zurita&Zurita Laboratorios,
por su incondicional apoyo. Al personal de los
laboratorios de Microbiología, de Biología del
Desarrollo y del Laboratorio de Investigaciones de
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
65
Vargas A. 2012. Pruebas antimicrobianas de
secreciones cutáneas de Agalychis spurrelli
(Anura: Hylidae) en cinco especies de
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