Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
67
Sensibilidad antimicrobiana y detección de genes
de virulencia en aislados clínicos de Shigella spp.
Irina Villacrés
1
, Iliana Alcocer
1
, Jeannete Zurita
2
y Mercedes Rodríguez-Riglos
1
1
Laboratorio de Microbiología, Escuela de Ciencias Biológicas,
Ponticia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador, iralcocer@puce.edu.ec
2
Facultad de Medicina, Ponticia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
Recibido: 2015-08-07; aceptado: 2015-10-05
RESUMEN.- El género Shigella comprende las especies S. exneri, S. sonnei, S. boydii y S. dysenteriae,
bacterias responsables de la shigelosis. Éste género se caracteriza por la presencia de multirresistencia a
antibióticos y una variedad de factores de virulencia que permiten la infección al hospedero. El objetivo de
este estudio fue establecer la sensibilidad antimicrobiana y detectar genes de virulencia “Invasion plasmid
antigen H“, ipaH; “Invasion-associated locus”, ial; “Shigella toxin” Stx; “Shigella enterotoxin 1A”, set1A; y
“Shigella enterotoxin 1B”, set1B en aislados clínicos de Shigella spp. Se analizaron 79 aislados obtenidos de
Zurita & Zurita Laboratorios y del hospital Vozandes. Mediante serotipicación, se registraron tres especies:
S. exneri (64.6 %), S. sonnei (29.1 %), y S. boydii (6.3 %). La sensibilidad antimicrobiana siguió el método
de difusión con disco según las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI). La
resistencia obtenida fue a tetraciclina (96.20 %), ampicilina (94.9 %), trimetoprima/sulfametoxazol (86.1 %)
y cloranfenicol (84.8 %). No se registraron aislados de Shigella con resistencia a ciprooxacino, azitromicina
ni a ceftriaxona. Se determinó la presencia de genes de virulencia por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se determinó una alta prevalencia de los genes ipaH (91.1 %) e ial (82.3 %), los genes codicantes
de enterotoxina 1 (set1A y set1B) se encontraron en un 35.4 %. Los resultados obtenidos demuestran la
existencia de multirresistencia a antibióticos y cepas virulentas.
PALABRAS CLAVES: enterotoxinas, genes de virulencia, resistencia antimicrobiana, serogrupos, Shigella spp.
ABSTRACT.- The genus Shigella includes S. exneri, S. sonnei, S. boydii and S. dysenteriae, which are
producers of shigelosis. The genus are characterized due to multidrug resistance to antibiotics and a
variety of virulence factors that allow the infection to host. The objective of this study was to establish the
antibiotic susceptibility and detection of virulence genes in clinical isolates of Shigella spp.: invasion plasmid
antigen H (ipaH), invasion-associated locus (ial), Shigella toxin (Stx), Shigella enterotoxin 1A (set1A), and
Shigella enterotoxin 1B (set1B). We analyzed 79 strains from “Zurita & Zurita Laboratorios” and “Hospital
Vozandes”. Three species were identied: S. exneri (64.6 %), S. sonnei (29.1 %), and S. boydii (6.3 %) by
antiserum agglutination. The antimicrobial susceptibility was performed by following the disk diffusion
method and recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). High resistance
was observed to tetracycline (96.2 %), ampicillin (94.9 %), trimethoprim/sulfamethoxazole (86.1 %), and
chloramphenicol (84.8 %). No resistance was identied to ciprooxacin, ceftriaxone and azitromicin. The
analysis of the presence of virulence genes was performed using the Polymerase Chain Reaction (PCR). A
high prevalence of genes ipaH (91.1 %) and ial (82.3 %) was determined, the encoding genes of enterotoxin
1 (set1 and set1B) were found in 35.4 % of the isolates. The results demonstrate the existence of multidrug
resistances to antibiotics and virulent strains of the genus Shigella.
KEYWORDS: antimicrobial resistance, enterotoxins, serogroups, Shigella spp., virulence genes.
a la familia Enterobacteriaceae (Terragno et al.,
2007). Las cuatro especies del género Shigella que
provocan todas las manifestaciones clínicas de
la shigelosis, que pueden causar desde diarrea
acuosa hasta diarrea exudativa fulminante, son
Shigella dysenteriae, Shigella exneri, Shigella boydii y
INTRODUCCIÓN
El género Shigella (Shiga, 1989) comprende bacilos
Gram negativos de 0.3 a 1.0 μm diámetro y de 1
a 6 μm de longitud, no móviles, no formadores de
esporas, anaerobios facultativos, pertenecientes
REMCB 36 (2), 2015
68
asociados al género Shigella, los más relevantes en
este estudio son los que intervienen en la invasión y
colonización del epitelio intestinal como los genes
ipaH (invasión plasmid antigen H), que permite
la diseminación facilitada de Shigella a través de la
mucosa y la inhibición de la coagulación inducida
por trombina que provoca la eliminación de sangre
en las heces (Hale, 1991) e ial (invasión-associated
locus) que promueve la internalización e invasión
del tejido “blanco” gracias a la producción de
adhesinas e invasinas y permite la diseminación
intercelular de la bacteria y el traslado y secreción
de diversos factores de virulencia (Noriega et
al., 1999). El gen ipaH conocido como “invasión
plasmid antigen H” ha sido observado en el 99
% de aislados de Shigella, determinándose como
el gen más estable de detectar debido a que se
encuentra en el cromosoma y en el ADN plasmidial
en múltiples copias (Lin Thong et al., 2005).
La enterotoxina 1 (ShET-1), es una proteína
codicada en el cromosoma bacteriano por los
genes set1A (subunidad A de la proteína) de
309 pb y set1B (subunidad B de la proteína) de
147 pb. La importancia de la enterotoxina 1
en la virulencia de Shigella se ha descrito más
recientemente. Esta toxina parece relacionarse
con la fase temprana de la diarrea acuosa en la
shigelosis, expresándose con mayor frecuencia en
S. exneri 2a. Sin embargo, el mecanismo por el
cual inicia la diarrea durante la shigelosis aún no
está claramente denido (Vargas et al., 1999).
Otro factor de virulencia es la exotoxina Shiga, que
es liberada únicamente durante la lisis celular. Su
efecto es bloquear la síntesis proteica en la célula
eucariota (Henhly et al., 1996). La exotoxina Shiga
es una enterotoxina que se asocia con el serotipo A1
de S. dysenteriae. Esta exotoxina es codicada por
el gen Stx de 895 pb. La principal complicación de
la liberación de la toxina Shiga es el desarrollo del
Síndrome Urémico Hemolítico.
Por lo expuesto, el objetivo fue establecer la
sensibilidad antimicrobiana y detectar genes de
virulencia ipaH, ial, Stx, set1A y set1B en aislados
clínicos de Shigella spp., por medio de pruebas
fenotípicas y genotípicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Población de estudio.- El presente estudio incluyó un
total de 79 aislados clínicos de Shigella spp., obtenidos
en Zurita & Zurita Laboratorios (Quito, Ecuador) y
del hospital Vozandes en Quito. Fueron colectados
durante el año 2005 al año 2010. Las muestras
provienen de procesos infecciosos documentados.
Shigella sonnei. La enfermedad más grave resulta de
la infección causada por las especies S. dysenteriae
tipo 1. Se considera que la cepas de S. exneri son
menos virulentas, mientras que, las de S. boydii
y S sonnei, generalmente, originan episodios
autolimitados de diarrea acuosa con ebre. No se
ha establecido hasta el momento la razón por la
cual en los países industrializados predominan
las infecciones por cepas se S. sonnei y S. boydii,
mientras que, los aislamientos de S. dysenteriae y S.
exneri son característicos de los países en vías de
desarrollo (Zurita, 2012).
Su identicación se fundamenta en características
bioquímicas y antigénicas, en base a ellas se
describen cuatro especies: Shigella dysenteriae
(Shiga, 1898), perteneciente al serogrupo A; Shigella
exneri (Flexner, 1900), concerniente al serogrupo
B; Shigella boydii (Boyd, 1938), perteneciente al
serogrupo C; y, Shigella sonnei (Sonne, 1915),
perteneciente al serogrupo D. Los grupos A, B y
C se subdividen en serotipos (número arábigo)
y subtipo (letra minúscula) que son 12, 14 y 18,
respectivamente. El grupo D tiene un solo serotipo.
Todas ellas pueden causar disentería bacilar,
aunque con diferente gravedad (Zurita, 2012).
La Organización Mundial de la Salud (2010) estima
la ocurrencia de 165 millones de casos y 1.1 millones
de muertes por año, de las cuales alrededor de
576000 son de niños menores de 5 años de edad.
La transmisión de estas bacterias se produce
principalmente por ruta fecal-oral directa o
indirecta en lugares que se caracterizan por una
higiene deciente (Kotloff et al., 1999). La infección
surge posteriormente a la ingestión de 10 a 100
microorganismos y los síntomas se presentan de 12
a 96 horas relativas al período de incubación de la
bacteria (Mandell et al., 2009).
La shigelosis es una enfermedad diarreica aguda
autolimitada, sin embargo, hay condiciones en las
cuales se encuentra establecido el tratamiento cuyo
objetivo principal es bajar la carga microbiana y la
intensidad de los síntomas. Se recomienda el uso
de ceftriaxona en lactantes menores de 6 meses que
requieran hospitalización así como ciprooxacino
en adultos mayores con deshidratación severa.
Debido a que el inóculo es muy bajo, también
se recomienda tratamiento en los casos de
hacinamiento (Zurita, 2012).
El género Shigella presenta una variedad de
factores de virulencia que le permiten el ingreso
a la mucosa gástrica, evadiendo las defensas del
hospedero. Varios de estos factores han sido
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
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Culture Collection, ATCC: S. sonnei 25931; S. boydii
(1) 9207; y S. exneri (2b) 12022. Para los controles
negativos se utilizó una gota de cloruro de sodio al
0.85 % y la cepa Escherichia coli ATCC 25922.
Sensibilidad a los antimicrobianos.- Para este
procedimiento fue utilizado el método de difusión
con disco (Bauer et al., 1966) en agar Müller-Hinton
(Difco
TM
) con sujeción a las recomendaciones
propuestas por el Clinical and Laboratory Standars
Institute (CLSI, 2015).
Detección molecular de genes de virulencia en
Shigella spp.- La extracción del ADN total se realizó
con el empleo del método sugerido por Carvalho
et al. (2001). La conrmación de la integridad del
ADN para la realización de la reacción en cadena
de la polimerasa PCR fue realizada mediante la
amplicación del gen codicante de la subunidad
16S del ribosoma bacteriano. Los iniciadores
utilizados para la amplicación del gen 16S
descritos por Malhotra-Kumar et al. (2005) se
encuentran detallados en la Tabla 1. Para medir el
peso molecular de las bandas obtenidas se utilizaron
100 bp DNA Ladder Tracklt
TM
(Invitrogen). Como
control negativo se utilizó agua de grado molecular
y como control positivo para el gen 16S ARNr se
empleó la cepa S. exneri ATCC (2b) 12022.
El ciclo de amplicación del gen 16S fue llevado
a cabo en un termociclador Labnet Multigene
Model TC9600-G programando un ciclo de
desnaturalización inicial a 93° C por 3 minutos,
seguido de 27 ciclos, los cuales consistieron en
un paso de desnaturalización a 93° C por 30
segundos, seguido de un paso de anillamiento
a 59.3° C 45 segundos, y un último paso de
extensión a 65° C por 45 segundos; nalmente un
Los aislados se mantienen en la Colección
Bacteriana Quito Católica, CB-QCA del
Laboratorio de Microbiología en la Escuela de
Ciencias Biológicas con registro de los códigos
hospitalarios, fechas de aislamiento, origen de los
aislados, sexo y edad de los pacientes.
Identicación bioquímica del género Shigella.-
El género Shigella de acuerdo con sus reacciones
bioquímicas se identica como un bacilo no
mótil, no fermentador de lactosa, productor o no
de ornitina descarboxilasa según la especie, no
productor de triptofanasas y que presenta una
fermentación butilén-glicólica. Para evidenciar
este perl se realizaron las pruebas bioquímicas
estándares: agar con triple azúcar y hierro (TSI),
motilidad, indol, ornitina (MIO) y rojo de metilo
(RM)/Vogues-Proskauer (VP), a partir de colonias
aisladas en agar entérico Hecktoen (Difco, 2003).
Identicación serológica de las especies del
género Shigella.- La serotipicación se realizó
mediante la técnica de aglutinación en lámina
propuesta por Edwars y Edwing (1972) y conforme
a las recomendaciones del Manual Difco Shigella O
Antisera (2011). Mediante esta técnica se puso en
evidencia la presencia de antígenos somáticos O
enfrentando el antisuero polivalente (anticuerpo)
con la bacteria (antígeno). Las cepas fueron
enfrentadas con los cuatro antisueros policlonales
comerciales Difco Shigella Antisera Poly de
serogrupos: Grupo A, S. dysenteriae, serotipos 1-7;
Grupo B, S. exneri, serotipos 1-6; Grupo C, S. boydii,
serotipos 1-7; y, Grupo D, S. sonnei, serotipos I y II.
Para la utilización de los antisueros policlonales
y la validación de los resultados, se realizaron
controles positivos y negativos. Para el control
positivo se utilizaron las cepas American Type
Iniciador Gen de
virulencia
Secuencia de nucleótido (5’ a 3’) Tamaño
Amplicón (pb)
Referencia
16S rRNA F rrs GAGTACGACCGCAAGGTTGA 100 Malhotra-Kumar et al. (2005)
16S rRNA R rrs CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTG 100 Malhotra-Kumar et al. (2005)
ShET1AF set1A TCACGCTACCATCAAAGA 309 Fusano et al. (1995)
ShET1AR TATCCCCCTTTGGTGGTA
ShET1BF set1B GTGAACCTGCTGCCGATATC 147 Fusano et al. (1995)
ShET1BR ATTTGTGGATAAAAATGACG
ialR ial CTGGATGGTATGGTGAGG 320 Frankel et al. (1989)
ialR GGAGGCCAACAATTATTTCC
Shig1 ipaH TGGAAAAACTCAGTGCCTCT 423 Lüscher y Altewegg (1994)
Shig2 CCAGTCCGTAAATTCATTCT
StxF Stx CAGTTAATGTGGTTGCGAAG 895 Frankel et al. (1989)
StxFR CTGCTAATAGTTCTGCGCATC
Tabla 1. Iniciadores utilizados para la identicación de varios genes asociados a mecanismos de virulencia en Shigella spp y el 16S.
REMCB 36 (2), 2015
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CB-QCA 3349 Shigella exneri que posee cuatro de
los cinco genes en estudio: ipaH, ial, set1A y set1B.
Los productos de PCR fueron enviados a Macrogen
Korea para su secuenciamiento. Las muestras
fueron puricadas a partir de gel de agarosa con la
utilización del Kit Wizard ® SV Gel and PCR Clean-
Up System. Las secuencias fueron editadas con el
programa Genius versión 7.0 y alineadas con las
secuencias depositadas en el GENBANK mediante
la utilización de la herramienta BLAST.
Análisis estadístico.- El análisis porcentual de los
resultados se realizó mediante el empleo de Microsoft
Ofce Excel 2010 (©2010 Microsoft Corporation).
Para el estudio de los resultados obtenidos tanto en
la serotipicación como en la presencia de genes de
virulencia, y resistencia a antimicrobianos, se utilizó
el método estadístico de análisis de correspondencias
múltiples (MCA), con el cual se determinó la
contribución de varios factores en un simple
evento o resultado, mediante la comparación de los
diferentes serotipos utilizados, con la presencia de
genes y la resistencia a antibióticos individualmente.
Para este análisis se empleó el programa estadístico
informático “Statistical Package for the Social
Sciences” (SPSS) versión 12.0.
RESULTADOS
Población de estudio.- De los 79 aislados, 61
muestras (77.20 %) fueron obtenidas a partir de heces,
18 muestras (22.8 %) a partir de secreciones vaginales.
Identicación serológica de las especies del género
Shigella.- Por medio del método de aglutinación en
lámina se obtuvo la identicación de las especies
del género Shigella, obteniéndose 51 aislados (64.6
%) positivos para Shigella exneri, 23 aislados (29.1
%) para Shigella sonnei, 5 aislados (6.3 %) positivos
para Shigella boydii, y 0 % de aislados positivos para
Shigella dysenteriae (Figura 1).
ciclo de extensión a 72° C durante 5 minutos. Los
productos resultantes de la reacción en cadena de
la polimerasa fueron almacenados a -20° C hasta su
análisis electroforético.
Para la identicación de genes de virulencia
en Shigella spp., se emplearon los iniciadores
previamente descritos por Fusano et al. (1995) y
Lüscher y Altewegg (1994) los cuales se encuentran
detallados en la Tabla 1.
Para la reacción en cadena de la polimerasa se usó
el ADN total. Las condiciones de amplicación
utilizadas son descritas por Lin Thong et al. (2005)
y Vargas et al. (1999). Como control negativo se
utilizó agua de grado molecular en lugar de ADN
y como control positivo para todos los genes en
estudio se empleó la cepa CB-QCA 3349 Shigella
exneri pues este aislado posee cuatro de los cinco
genes en estudio: ipaH, ial, set1A y set1B.
La PCR fue estandarizada en un volumen de 25
μl, que contiene: 12.5 μl de Green 0.4 mM de cada
iniciador (Invitrogen) y 1 μl de ADN.
El programa de amplicación de los genes se realizó
en un termociclador Labnet Multigene Model
TC9600-G. Se inició el programa de PCR con una
desnaturalización inicial de 95° C por 5 minutos,
seguido de 30 ciclos con una desnaturalización a 95° C
durante 50 segundos, anillamiento, para los genes
ipaH, ial, y set1B a 52°C por 1.5 minutos; para el gen
set1A a 48° C por 1.5 minutos; para el gen Stx a 55° C
por 1.5 minutos; y, extensión a 72º C durante 2
minutos, seguido de un ciclo de extensión nal a
72° C por 7 minutos.
El peso molecular de las bandas obtenidas para
cada gen fue estimado visualmente mediante el
uso de 100 bp DNA Ladder Tracklt
TM
(Invitrogen).
Análisis de los productos de amplicación.- Los
productos de PCR fueron analizados mediante
electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1.0
% en tampón TBE 1 X (89 mM de Tris, 89 mM de
ácido bórico y 2.50 mM de EDTA). El programa de
electroforesis consistió en la aplicación de 8V/cm
durante 45 minutos en tampón TBE 0.5 X. La tinción
del gel se realizó con el empleo de SYBRGold
(Invitrogen). Los resultados fueron documentados
en el sistema de captura de imágenes MiniBis Pro
(DNR Bio- Imaging Systems) con la ayuda del
programa informático GelCapture 4.5.3.
Validación de los genes de virulencia.- Para
validar el protocolo de amplicación y conrmar la
identidad de la cepa se utilizó como control el aislado
Figura 1. Porcentaje de identicación de las diferentes especies
en la población total de aislados de Shigella spp. N=79
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
71
el gen ial se presentó en 65 aislados (82.3 %), 47
aislados (59.5 %) presentaron el gen set1B y 32
aislados (40.5 %) el gen set1A. Ningún aislado
evidenció presencia del gen Stx (Figura 4). Seis
aislados (7.6 %) no presentaron ningún gen de los
analizados en este estudio.
Según el análisis estadístico existe alta
heterogeneidad en los patrones de resistencia al
relacionarlos con las especies con una concentración
superior de casos de S. exneri multirresistentes en
relación con las otras especies.
La presencia de los cuatro genes ipaH, ial, set1A y
set1B en conjunto se encuentra exclusivamente en
S. exneri. Para S. sonnei se observó una mayor
concentración de casos con presencia de genes
set1A y set1B. En el caso de S. boydii se observó una
mayor presencia del gen ial.
En la Tabla 2 se encuentran en detalle los patrones
de virulencia en Shigella. Shigella exneri tiene
De los 51 aislados de Shigella exneri, 33 (64.7 %) fueron
aislados de heces y 18 (35.3 %) de secreción vaginal.
De los 23 aislados de Shigella sonnei, 23 (100 %) fueron
aislados de heces. De los 5 aislados de Shigella boydii,
también el 100 % fueron aislados de heces.
Sensibilidad a los antimicrobianos.- La
sensibilidad a antimicrobianos obtenida para
los diferentes antibióticos enfrentados con los
aislados de Shigella spp., se observa en la Figura
2. Analizando globalmente el género, se observó
que 76 aislados (96.2 %) presentan una resistencia a
tetraciclina, 75 aislados (94.9 %) fueron resistentes a
ampicilina, 68 aislados (86.1 %) fueron resistentes a
trimetoprima/sulfametoxazol, 67 aislados (84.8 %)
presentaron resistencia a cloranfenicol, 7 aislados
(8.9 %) fueron resistentes a ácido nalidíxico,
4 aislados (5.1 %) presentaron resistencia a
nitrofurantoina y no se encontró aislamientos
con resistencia a ciprooxacino, azitromicina ni a
ceftriaxona, (Figura 2). Como control positivo fue
incluido el análisis de las cepas ATCC: S. sonnei
25931, S. boydii (1) 9207 y S. exneri (2b) 12022,
las cuales mostraron sensibilidad a todos los
antibióticos utilizados.
Detección molecular de los genes de virulencia en
Shigella spp.- Para el gen 16S ARNr se obtuvo un
98 % de identidad, para el gen ipaH se obtuvo un
100 % de identidad, para el gen ial se obtuvo el 99
% de identidad en un total de 10 secuencias donde
se producen alineamientos signicativos, para el
gen set1A se obtuvo 100 % de identidad y para el
gen set1B se obtuvo un 99 % de identidad.
Análisis de presencia o ausencia de genes de
virulencia.- El análisis de la presencia de los genes
fue evidenciado mediante la amplicación en gel
de agarosa obteniéndose las bandas con el peso
especíco para cada gen estudiado (Figura 3).
Los resultados obtenidos para el total de 79 indican
que 72 aislados (91.1 %) presentaron el gen ipaH,
Figura 2. Porcentaje de resistencia a antibióticos dentro de la
población de Shigella spp. N=79
Figura 3. Representación fotográca en gel de agarosa de la
amplicación de los genes ipaH, ial, set1A y set1B en Shigella
spp. M, marcador de peso molecular (100pb); Pocillo 1, control
positivo gen ipaH cepa CB-QCA 3349 Shigella exneri; Pocillo
2, muestra positiva de Shigella spp. para el gen ipaH; Pocillo
3, control positivo gen ial cepa CB-QCA 3349 Shigella exneri;
Pocillo 4, muestra positiva de Shigella spp. para el gen ial; Pocillo
5, control positivo gen set1A cepa CB-QCA 3349 Shigella exneri;
Pocillo 6, muestra positiva de Shigella spp. para el gen set1A;
Pocillo 7, control positivo gen set1B cepa CB-QCA 3349 Shigella
exneri; pocillo 8, muestra positiva de Shigella spp. para el gen
set1B; Pocillo 9, control negativo, agua de grado molecular.
Figura 4. Porcentaje de presencia de los genes set1A, set1B, ial,
ipaH y Stx en la población total de aislados de Shigella spp. N=79
REMCB 36 (2), 2015
72
DISCUSIÓN
Las enfermedades diarreicas a nivel mundial han
sido atribuidas a diferentes agentes infecciosos y
uno de los más comunes es Shigella. Mundialmente
se producen unos dos mil millones de casos de
diarrea cada año y se consideran como la segunda
mayor causa de muerte de niños menores de
cinco años (OPS, 2009). A nivel de Latinoamérica
y el Ecuador las enfermedades diarreicas agudas
(EDA) son la segunda causa de morbilidad en la
población en general y de mortalidad en niños
menores de 5 años y adultos mayores (INEC,
2009). Al ser las enfermedades transmitidas por
alimentos un problema de salud a nivel mundial se
considera imprescindible realizar la capacitación en
identicación y determinación de la sensibilidad de
los antibióticos en enfermedades entéricas debido a
razones epidemiológicas (OPS, 2009).
principalmente el patrón de virulencia 1 con la
presencia de los genes ipaH, ial, set1A y set1B
con 28 aislados que indican la producción de la
enterotoxina 1 (set1A y set1B), la producción de
los genes de la invasión y colonización del epitelio
intestinal (ipaH) y de la producción de adhesinas
e invasinas que permiten la diseminación
intercelular de la bacteria (ial). En esta especie
todos los aislados presentaron el gen ipaH excepto 4
aislados que no tuvieron ningún gen. En la especie
S. sonnei el patrón de virulencia prevalente fue
el 4 con la presencia de los genes ipaH, ial y set1B
en 11 aislados. En esta especie todos los aislados
presentaron el gen ipaH excepto 2 aislados que no
tuvieron ningún gen. Finalmente en la especie S.
boydii se vio principalmente el patrón de virulencia
ipaH, set1B, ial y el patrón ipaH, ial. Todos los
aislados en esta especie tuvieron el gen ial.
en países en vías de desarrollo la circulación
prevalente es de S. exneri y S. dysenteriae; mientras
que, S. sonnei y S. boydii son característicos en
países industrializados.
En el presente estudio se observó que la especie
más común es S. exneri con un 64.6 %, seguida por
S. sonnei con un 29.1 %, S. boydii con un 6.3 % y
no se reportó S. dysenteriae. Estos datos concuerdan
con los datos publicados para Latinoamérica,
especialmente estudios realizados en Brasil,
Uruguay, Cuba y Argentina donde la información
para la prevalencia de estas especies de Shigella
es similar (Mota et al., 2005; Merino et al., 2004;
Ramírez et al., 2004; Silva et al., 2008).
Durante años las enfermedades diarreicas como
la shigelosis han sido tratadas mundialmente
con el uso de antibióticos como trimetoprima/
sulfametoxazol, ampicilina, ciprooxacino y
azitromicina (Silva et al., 2008). Sin embargo, la
Entre los marcadores fenotípicos la serotipicación
es el método de mayor agudeza para la especiación
del género Shigella. Este método permite realizar
estudios de vigilancia que determinen la prevalencia
de serogrupos y serovariedades en diferentes
zonas geográcas, ya sea en estudios de brotes o
de casos esporádicos (Guerrant et al., 1999). En este
estudio se utilizó con el 100 % de éxito el método de
serotipicación en los aislados de Shigella se obtuvo
la presencia de las especies S. exneri, S. sonnei y S.
boydii. No se han registrado en revistas indexadas,
hasta la fecha, cepas de S. dysenteriae en el Ecuador
ni en 10 años de vigilancia de la resistencia (Zurita,
2012). En este estudio, mediante serología, no se
identicó S. dysenteriae.
Estudios relativos a la identicación de especies
dentro del género Shigella han determinado que
Tabla 2. Patrones de virulencia mostrados por los aislados de Shigella spp.
ipaH, invasión plasmid antigen H; ial, invasión-associated locus; set1A, enterotoxina 1-subunidad A; set1B, enterotoxina 1-subunidad B.
Especies
Genotipos de virulencia Patrón S. exneri S. sonnei S. boydii Total de cepas %
1 ipaH,set1A,set1B, ial 28 28 35.4
2 ipaH, ial 7 7 2 16 20.3
3 ipaH, set1A, ial 1 1 1.3
4 ipaH, set1B, ial 6 11 2 19 24.1
5 ipaH, set1A 2 1 3 3.8
6 ipaH 3 2 5 6.3
7 ial 1 1 1.3
8 ninguno 4 2 6 7.6
Total 51 23 5 79 100.0
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
73
perianal por un cuadro anterior de diarrea y
que por la proximidad anatómica llega a la zona
genital, causa un proceso inamatorio de la vulva
y vagina acompañado de sangrado. Esto se debe
a que la siopatología de Shigella se maniesta
de igual manera que en el epitelio intestinal, en
el epitelio vaginal que está exento de estrógenos
(Ocampo et al., 2014).
El género Shigella produce principalmente
enfermedades diarreicas que pueden llevar a
serias complicaciones debido a que las diferentes
especies integrantes del género presentan factores
de virulencia como genes de invasión celular,
enterotoxinas y exotoxinas que afectan severamente
al paciente, lo cual posteriormente en casos severos
puede llevar a la muerte (Jiménez y Achí, 2009).
El gen ipaH es considerado uno de los genes más
estables y presentes en todas las especies de Shigella
en razón que se encuentra tanto en el cromosoma
bacteriano como en múltiples copias en ADN
plasmidial (Lin Thong et al., 2005) además este
gen se encuentra identicado en otras bacterias
patógenas como en E. coli enteropatógena, por lo
que se lo considera un gen con altas características
virulentas (Aranda et al, 2004). En los análisis
realizados el gen ipaH fue encontrado en el 91.1 %
de los aislados, postulándose como el de mayor
presencia dentro de los genes analizados en este
estudio. La variación de este porcentaje con lo
descrito por otros autores se puede deber a que
las cepas negativas sufrieron mutación o deleción
del gen (Silva et al., 2008). Aunque esto es muy
poco probable ya que el gen se encuentra en el
cromosoma bacteriano y en copias en el plásmido
de invasión, estos casos se observan en cepas poco
virulentas o algunas que se han mantenido en
congelación por mucho tiempo como es el caso de
los aislados utilizados en este estudio (Silva et al.,
2008). Siete aislados (8.9 %) no presentaron el gen
ipaH de estos 6 (7.6 %) tampoco presentaron los
otros genes de estudio.
Aunque el gen ial está encargado de permitir la
invasión celular, en algunos casos no se observó
la presencia de éste. Tal comportamiento se debe
a que el gen ial reside en una región del plásmido
que es un “hot spot” para deleción espontánea
(Lin Thong et al., 2005). En este estudio se
comprobó esta afirmación obteniéndose una
presencia del gen en los aislados estudiados del
82.3 % y es el segundo gen presente dentro de los
analizados en este trabajo.
En estudios anteriores autores describen que
la presencia de los genes set1A y set1B juntos,
únicamente se observan en la especie S. exneri
aparición de aislados multirresistentes ha limitado
el tratamiento y ha incrementado la prevalencia
de la enfermedad (Silva et al., 2008). La diversidad
de fenotipos de resistencia mostrados por los
aislados pudiera deberse a que la resistencia de
este es mediada por plásmidos, con la excepción
para quinolonas y azitromicina y además por
integrones o transposones que estén incorporados
al cromosoma bacteriano (Ramírez et al., 2004).
Estudios competentes relacionados con la
resistencia a antimicrobianos en Shigella spp. en
países de Latinoamérica como Brasil, Chile, Cuba,
Argentina, y Uruguay reportan una alta resistencia
a los antibióticos trimetoprima/sulfametoxazol,
cloranfenicol y ampicilina (Silva et al., 2008; Boehme
et al., 2002; Ramírez et al., 2004; Vila et al., 1994;
Mota et al, 2005). Mientras que para países como
Canadá, Senegal e India se reporta una resistencia a
la ampicilina y tetraciclina (Bassa et al, 2010).
Para Ecuador según Zurita (2012) el porcentaje
de resistencia en Shigella exnerii a ampicilina,
tetraciclina, trimetoprima/sulfametoxazol y
cloranfenicol sobrepasa el 60 %. Durante la
vigilancia del año 2000 al 2010 no se han detectado
aislamientos de Shigella resistentes a cefalosporinas
de tercera generación y quinolonas. Las otras
especies de Shigella como S. boydii y S. sonnei se
aíslan en bajo número por lo que, no permiten sacar
conclusiones de porcentaje resistencia. No se han
detectado aislamientos de S. dysenteriae durante
estos diez años de vigilancia.
En este estudio se observó una alta resistencia
a tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina y
trimetoprima/sulfametoxazol lo que concuerda
con los datos reportados a nivel mundial y
especialmente en Latinoamérica (Bassa et al.,
2010; Zurita, 2012).
Debido a que en los niños no está indicado el uso
de ciprooxacino, se recomienda alternativamente
utilizar el ácido nalidíxico (Replogle et al., 2000), pero
el inconveniente es que su uso genera rápidamente
resistencia. La cefalosporina de tercera generación
como ceftriaxona está indicada para lactantes que
requieren hospitalización debido a la gravedad del
cuadro clínico. En adultos y niños menores de 5
años está indicado ciprooxacino como droga de
primera elección y la azitromicina está indicada
para los niños que pueden ser manejados en forma
ambulatoria (Saurina et al., 2000).
En este estudio 18 aislamientos provinieron de
muestras de secreción vaginal aisladas en niñas
menores de 9 años. La vulvovaginitis causada
por Shigella, se debe a colonización de la zona
REMCB 36 (2), 2015
74
muy baja resistencia a nitrourantoina. No se
registraron aislados de Shigella con resistencia
a ciprooxacino, azitromicina ni a ceftriaxona.
•Los genes de virulencia se encuentran en alta
proporción en los aislamientos de Shigella
principalmente los genes ipaH e ial. Los genes
ipaH permiten la invasión y colonización del
epitelio intestinal y los genes ial la formación
de adhesinas e invasinas y la diseminación
intercelular de la bacteria.
•Los genes set1A y set1B productores de
la enterotoxina 1 ShET-1 se encontraron
exclusivamente en la especie S. exneri que es
la especie prevalente lo que contribuye a una
mayor toxicidad.
•No se encontró Shigella toxin, esto se debe que esta
toxina es producida en su mayoría para la especie
S. dysenteriae y en el análisis no se identicó esta
especie dentro de las muestras aisladas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al grupo de trabajo
del Laboratorio de Microbiología de la Escuela
de Ciencias Biológicas, PUCE, Quito, a todo
el personal de Zurita & Zurita Laboratorios y
del hospital Vozandes, Quito. Este estudio fue
realizado con fondos del Proyecto “Diversidad
Genómica y perl de resistencia a antimicrobianos
en bacterias entéricas” (Código de Proyecto
G13019) y del proyecto “Genotipaje de la resistencia
a antimicrobianos en bacterias entéricas” (Código
G13034) nanciados por la Ponticia Universidad
Católica del Ecuador.
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altamente conservados en esta especie (Noriega et al.,
1995; Vargas et al., 1999). Según los datos recopilados
en este análisis, se ratica lo antes mencionado
porque se obtuvo un 35.4 % de presencia de estos
genes juntos y dentro de este porcentaje el 100 %
de los aislados positivos pertenecen a la especie
S. exneri, es decir que al presentarse en conjunto
estos dos genes únicamente en la especie S. exneri
se podría armar que esta es la única especie
productora de la enterotoxina ShET-1.
La presencia de uno de los genes no indica que
la cepa sea virulenta por lo que es importante
evaluar los resultados globalmente (Lin Thong et
al., 2005). En este estudio se formaron patrones
de virulencia según los genotipos encontrados en
los aislados estudiados. El patrón de virulencia
con mayor presencia es el número 1 (ipaH, set1A,
set1B, ial) lo que signica que la mayoría de los
aislados presentan 4 de los 5 genes estudiados.
Estos resultados sugieren que la mayoría de cepas
aisladas son de carácter altamente virulento.
Los análisis estadísticos demostraron que existe
una relación entre las especies y su patogenicidad
y virulencia, así se determinó a la especie S. exneri
con la mayor presencia de los genes de virulencia
estudiados y con la mayor multirresistencia
a antimicrobianos. Las especies S. sonnei y S.
boydii presentan a su vez genes de virulencia y
multirresistencia pero en menor proporción que la
especie S. exneri.
Los resultados conseguidos en este estudio
representan los primeros relacionados con genes
de virulencia y resistencia a antibióticos en el país.
En esta bacteria se observó claramente la presencia
de cepas multirresistentes a antibióticos utilizados
comúnmente como tratamiento primario de
shigelosis, esto, combinado con la alta virulencia de
las cepas, representa un problema para el control y
tratamiento de esta bacteria.
CONCLUSIONES
•La mayor prevalencia se determinó en la especie
S. exneri (64.6 %), seguida de la especie S. sonnei
(29.1 %) y nalmente la especie S. boydii (6.3 %).
No se identicaron aislados pertenecientes a la
especie S. dysenteriae.
•Los aislados de Shigella exneri, S. sonnei
y S. boydii presentaron mayor resistencia
a tetraciclina, seguido de ampicilina,
trimetoprima/sulfametoxazol y nalmente,
cloranfenicol. Mientras que presentaron una
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
75
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