REMCB Formato de modalidad nota científica
1
Primer reporte
de
Botrytis cinerea
causante del moho gris en hojas de uvilla en el norte del
1
Ecuador
2
First report
of
Botrytis cinerea
as the causal agent of gray mold on goldenberry leaves in
3
northern Ecuador
4
5
Renata Lozada
1
, Alexis Quintana
1
, J
eniffer Yánez
1
6
7
1
Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico.
Pontificia Universidad Católica del Ecuador.
8
170102, Quito, Ecuador.
9
10
Resumen.
-
La uvilla (
Physalis peruviana
L
.
) es una especie vegetal nativa de los Andes
y de
11
importancia económica para la región
.
Sus
características organolépticas y propiedades
bioactivas
12
han despertado interés en el mercado nacional e internacional.
E
x
isten
varios organismos como
virus,
13
bacterias
,
nematodos
y hongos
que provocan enfermedades graves en
este cultivo
.
Estos últimos
14
a
fectan tanto al cultivo como la post cosecha de uvilla. El moho gris es
una
enfermedad causada por
15
Botrytis cinerea
. Est
e
hongo produce
manchas
foliares
redondas de color marrón con cubrimiento de
16
micelio
,
responsable del
aspecto de moho gris. Este hongo
tiene la capacidad de
provocar
17
debilitamiento general de la hoja hasta la muerte de la
planta
. Por
ello
, el objetivo de est
a
18
investigación fue identificar a
B
.
cinerea
en cultivos de uvilla de la zona norte del Ecuador. Se
19
muestrearon varias parcelas ubicadas en la provincia de Imbabura
.
Los aislados fúngicos
obtenidos
20
se
identificaron
a nivel fenotípico
y molecular
mediante a
nálisis
de la región ITS. Las secuencias se
21
c
ompararon
con dos bases de datos
donde presentaron una similitud del 100
% para
B
.
cinerea
.
22
Finalmente,
l
os
postulados de Koch confirm
aron
que
B
.
cinerea
es el hongo causante del moho gris
23
en
hojas de los
cultivos
de uvilla en Ecuador.
24
25
Palabras clave:
Botrytis cinerea
, moho gris,
postulados de Koch, fitopatógeno,
Physalis peruviana
.
26
27
Abstract.
-
The
g
oldenberry (
Physalis peruviana L.
) is a species plant native to the Andes
and
28
economic important for the region.
Due to its organoleptic characteristics and
bioactive
properties,
29
it has aroused interest in the national and international market.
S
everal organisms such as viruses,
30
bacteria
,
nematodes
and fungal
cause
serious
dis
eases to the
crop
. The last
affect
both
the crop
31
growing and post
-
harvest of goldenberry. Gray mold is the disease caused by
Botrytis cinerea
. Round
32
brown
leaf
spots covered with mycelium giving the appearance of gray mold characterize this disease.
33
This f
ungus
causes
general weakening of the leaf until
its
death.
T
he objective of this research was
34
to identify
B
.
cinerea
in goldenberry crops in
the
northern
area of
Ecuador. Several plots located in
35
the province of Imbabura were sampled. The fungal isolates
obtained were
identified
phenotypically
36
and by molecular techniques that analyzes the ITS region
.
Sequences were
compared
with
two
37
databases
and showed
a 100
% similarity for
B
.
cinerea
. Finally, through Koch's postulates, it was
38
confirmed that
B
.
cinerea
wa
s the phytopathogenic fungus that causes gray mold
in leaves of
39
goldenberry
crops in Ecuador
.
40
41
Key words:
Botrytis cinerea
, gray mold,
Koch postulates
,
phytopathogen,
Physalis peruviana
.
42
43
Introducción
44
La uvilla (
Physalis peruviana
L.
)
también conocida como uchuva o baya dorada es una especie
45
vegetal nativa de los Andes
. Esta planta se desarrolla, comúnmente, en
zonas altas
comprendidas
46
entre 1500 y 3000 msnm
. A lo largo de dos años
de vida forma un arbusto perenne que alcanza 1.0
-
47
1.6
metros
mediante un
crecimiento simpodial
.
Las
hojas son aterciopeladas con un tamaño
48
comprendido entre 5 y 15 cm de largo y de 4 hasta 10 cm de ancho con forma de corazón
.
El capuchón
49
o cáliz es ahuecado y está formado por cinco hojas lobuladas con puntas
triangulares que protegen al
50
fruto de ambientes extremos, insectos y patógenos
.
Posee una raíz resistente que puede llegar a medir
51
más de 60 cm
de largo
y el tallo es verde de textura suave, pero con ligeras vellosidades
(Fischer et
52
REMCB Formato de modalidad nota científica
2
al. 2014).
La uvilla s
e caracteriza por sus bayas de color amarillo
-
anaranjado, de piel lisa en forma
53
glob
ular
con sabor ligeramente
ácido
.
Entre las propiedades nutricionales del fruto están
:
fuente de
54
vitamina A, vitamina C, vitaminas del complejo B, pectina y flavonoides (Co
rrales
-
Bernal et al.
55
2015).
Además, se
le atribuyen
distintas propiedades antibacteriales y antiinflamatorias (
Çakir
et al
.
56
2014
).
El cultivo y la comercialización de uvilla es una de las principales fuentes económicas
en
57
Ecuador (Moreno
-
Miranda et al. 201
8).
La producción de uvilla
se
destaca en la provincia
del Carchi
58
(40%), seguid
a
de Imbabura (28%) y finalmente Pichincha (6%), sumando más del 70% de
59
producción de la fruta en el país (PROECUADOR 2020). En el 2019,
las exportaciones crecieron
60
hacia varios
destinos, tanto en Europa como América
(PROECUADOR 2020). Datos del Ministerio
61
de Producción Comercio Exterior, Inversiones y Pesca y el Banco Central del Ecuador indican que
62
en el año 2019 se exportaron alrededor de 208 mil dólares de uvilla fresca y un
total de 657 mil
63
dólares de uvilla deshidratada, datos que alientan al sector agrícola reflejando un crecimiento en el
64
promedio anual de 53.1
% en comparación de años anteriores (PROECU
A
DOR 2020).
65
66
L
os cultivos de uvilla
presentan
vari
os problemas
fisiológicos
relacionados
con
virus, bacterias y
67
nematodos que provocan enfermedades graves en la planta
.
Los
fitopatógenos de origen fúngico
68
afectan
durante
e
l
c
recimiento de las plantas
y la
post
cosecha
,
c
ompromet
iendo
el desarrollo de la
69
pla
n
ta y, por ende,
el
rendimiento
final
del cultivo
.
L
as enfermedades fúngicas más comunes en uvilla
70
son
la mancha gris producida por
Cercospora
spp
.
(Paredes, Yánez y Marcial
-
Coba 2021)
, la muerte
71
descendente ocasionada por
Phoma
spp
.,
la marchitez vascular por
Fusarium oxysporum
y el moho
72
gris causado por
Botrytis
cinerea
(Día
z
, Chaves
-
Acuña y Yánez 2019)
.
El moho gris
es una
73
enfermedad que provoca necrosis localizada en su estado inicial y conforme avanza llega a causar la
74
pudrición de
las hojas, flores y frutos, acompañado de un cubrimiento externo de micelio. El mismo
75
se esparce con rapidez por toda la planta logrando su pudrición total (
Jakobija et al. 2020
).
El hongo
76
B. cinerea
es considerado
un fitopatógeno
muy agresivo,
se caracteriza por ser un
microorganismo
77
necrotrófico que afecta los cultivos de mora, fresa, tomate y a más de 200 plantas cultivables entre
78
las que se encuentra la uvilla (Marín
-
Chacón et al. 2017).
La
diseminación
es rápida y
se da gracias
79
a la presenc
ia de conidios que son estructuras fácilmente distribuidas mediante
corrientes de aire,
80
herramientas o lluvia (Chen et al. 20
21
).
Además, tiene la capacidad de per
ma
necer
latente en el
81
tejido
de hojas jóvenes
y cuando la hoja madura
,
se activa provocando lesiones redondas de color
82
marrón seguido del cubrimiento de
micelio
gris
(Jakobija et al. 2020)
.
83
84
En Colombia
,
existen mayores estudios acerca de
B
. cinerea
presente en
P
.
peruviana,
pero, s
u
85
importancia
radica en
el grave
deterioro
que provoca en el fruto, lo
que impide su comercialización
.
86
Por ejemplo, se comprob
ó
la presencia
de
B.
cinerea
en
frutos
de uvilla
listos para distribución, luego
87
de 30
días
con secado del cáliz
(
Novoa et al. 2006;
Catarina 2014).
Hasta el
momento
, en el Ecuador,
88
los reportes
son escasos en cuanto al manejo y desarrollo tanto en
hojas
como en fruto
.
Por ello,
existe
89
un vacío
dentro del
sector
agrícola
l
o que impide un correcto
desarrollo de
estrategias para el control
90
fitosanitario
y crea un
a rápida
pérdida de tiempo y recursos
(Roca
-
Couso et al. 2021)
.
91
92
El presente
estudio
tiene como objetivo
i
dentifica
r a
B. cinerea
como causante de la enfermedad moho
93
gris en hojas de uvilla
en plantaciones
de
los
A
ndes de
Ecuador.
Esta información
es requerida como
94
evidencia para
la correcta y oportuna identificación de este hongo fitopatógeno. Además,
de
95
contribuir
con información base para
en el control y la actualización del manejo fitosanitario del
96
cultivo de uvilla en el país.
97
98
Materiales y Mé
todos
99
Área de investigación y muestreo
.
-
El estudio se realizó
en parcelas
productoras de uvilla
(
ecotipo
100
manzana)
ubicadas en la provincia de Imbabura
(
0° 15' 25.279" N
78° 20' 22.372"
W
), m
ediante
101
muestreo aleatorio estratificado
(Hernández
y Carpio
2019)
.
S
e escogieron 25 plantas por parcela y
102
se seleccionaron las hojas de uvilla que presentaron síntomas propios del moho gris causado por
B.
103
cinerea
(
Richards
et al. 2021). Las muestras fueron recolectadas en fundas de plástico con cierre
104
REMCB Formato de modalidad nota científica
3
hermético y
e
tiquetadas
con
fecha, hora de recolección y georreferencia. Se trasladaron en cadena de
105
frío (4 °C) hasta el laboratorio de Fitopatología y Control Biológico de la Pontificia Universidad
106
Católica del Ecuador (PUCE), para su procesamiento en un lapso máximo
de 24 horas (Agrios 2005).
107
Aislamiento y purificación del hongo fitopatógeno
.
-
Las muestras fueron previ
amente lavadas con
108
agua potable
para eliminar contaminantes superficiales. Se cortó con un bis
turí estéril, pedazos de 5
109
mm
2
de las lesiones foliares. Los cortes fueron desinfectados durante
un
minuto en hipoclorito de
110
sodio al 1 %, seguido de etanol al 70 % por 30 segundos y, por último, dos enjuagues con agua
111
destilada estéril por
un
minuto (Agrios 2005).
L
os pedazos de hoja
se sembraron en cajas Petri con
112
PDA (Papa Dextrosa Aga
r
), suplementado con 80 mg/L de gentamicina para inhibir el crecimiento
113
bacteriano (Morales
-
Restrepo y Cardona
-
Castro 2018). Las cajas de Petri se incubaron a temperatura
114
ambiente (23 ± 2 ºC) durante
si
ete
días
hasta obtener colonias típicas de
B. cinerea
(
F
a
rrera et al.
115
2007
;
Javed et al. 2017),
además,
se
realizó
el
cultivo monospórico
en medios de cultivo PDA y MEA
116
(Malt Extract Agar
;
Swart et al. 2001).
117
Identificación macroscópica y microscópica
.
-
Para la identificación macroscópica se realizó un
118
control cotidiano
a los cultivos puros
durante 14 días
.
Los aspectos
considerados respecto
a
la colonia
119
fueron: color, textura, bordes y presencia de esclerocios, características que se compararon con
120
estudios previos (Mamode Ally et al. 2021). El ancho y el largo de 10 esclerocios formados en
121
cultivos con PDA fueron medidos (Plaza et al. 2018
).
Para la identificación microscópica se utilizaron
122
cajas Petri con PDA de
siete
días de crecimiento (F
a
rrera e
t al. 2007). El microcultivo se llevó a cabo
123
en una caja mono
Petri de vidrio esterilizada con papel absorbente de base, se añadió una varilla de
124
vidrio sobre el papel para dar elevación al portaobjeto, sobre el que se colocó una lámina de 15 mm
2
125
de agar P
DA. Con la ayuda de un asa
en punta
se inocularon conidios en los cuatro lados de la lámina,
126
sobre la que se añadió un cubreobjetos Adicionalmente, se agregó 1 mL de agua estéril sobre el papel
127
absorbente, para
mantener
humedad,
se selló la caja mono
Petri
con Parafilm
®
y se incubó a 23 ± 2
128
°C durante
siete
días (Medina et al. 1999). En otro portaobjetos se colocó una gota de agua destilada
129
en el centro y cubrió con el cubreob
jeto
.
Los conidios y los conidióforos fueron l
as estructuras
130
fúngicas
observadas m
ediante
microscopio óptico con
aumento total de 400 X
.
Por último, se midió
131
el tamaño de 50 conidios por cepa (Wang et al. 2011) con la herramienta digital DinoCapture 2.0.
132
Las medidas de los
esclerocios
(ancho por largo en milímetros) y los conidios (ancho por lago en
133
micras) fueron tomadas durante el crecimiento del hongo en PDA.
134
Identificación molecular
.
–
E
l ADN
fúngico se
extrajo
de los aislados que crecieron
en PDA
por
135
siete
días
,
mediante
el kit Wi
zard® Genomic DNA Purification (Promega
2019). La PCR (reacción
136
en cadena de la polimerasa, por sus siglas en inglés), amplific
ó
la región ITS (Espaciadores
137
Transcritos Internos, por sus siglas en inglés). Los
cebadores
utilizados fueron ITS
-
1 e ITS
-
4 (ITS
1:
138
5’
-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
-
3’; ITS4: 5’
-
TCCTCCGCTTATTGATATGC
-
3’) (White et al.
139
1990
;
Kwon
et al. 2011
;
Fajarningsih 2016
). El volumen final de cada reacción fue de 25 µ
L
y los
140
parámetros de amplificación fueron: la desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 minuto, seguido
141
por 30 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 95 °C, el alineamiento de 30 segundos a 55 °C,
142
la elongación por 1 minuto a 72 °C, para concluir
la elongación final por 5 minutos a 72 °C. A
143
continuación, se realizó una electroforesis
en
gel de agarosa al 1.5 % (95 voltios por 60 minutos)
144
(Núñez
-
Ríos
et al. 2013). Los productos de
la
PCR se enviaron a Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur)
145
donde fuero
n purificados y secuenciad
os por el método de Sanger. L
as secuencias
resultantes
forward
146
y
reverse
fueron alineadas con la herramienta informática Clustal W del programa MEGA X (Notte
147
et al. 2021).
Se
identificó
coincidencias de e
stas secuencias
en la
s bas
es de datos
GenBank
de
l
NCBI
148
mediante la herramienta BLAST y en MycoBank (Wang et al. 2011
;
Gümrükcü et al. 2016).
149
Postulados de Koch
.
-
Se sembraron 27 plántulas en
macetas
plásticas con sustrato estéril compuesto
150
de vermiculita (PRO
-
MIX®) y regadas a ca
pacidad de campo diariamente. Las plantas se
151
mantuvieron en invernadero con una temperatura aproximada de 20
-
25 °C y 70
-
79 % de humedad
152
(Gao et al. 2018). El inóculo se preparó con
cinco
cepas de
B
.
cinerea
obtenid
a
s de 14 cajas Petri con
153
agar
PD
A
, dos
cajas por cada
aislado del hongo fitopatógeno con crecimiento de
siete
días a 25 °C
154
(Mirzaei et al. 2007).
Se
cortaron discos de agar de 5 mm de diámetro
para inoculación directa
(Wang
155
et al. 201
1
;
ÖZer y Bayraktar 2014).
La inoculación del patógeno se re
alizó
c
uando las plantas
156
REMCB Formato de modalidad nota científica
4
presentaron cinco hojas verdaderas. En
12
plantas
se colocaron d
iscos de agar con micelio
de
acuerdo
157
con el tamaño de la hoja (entre 2 o 4)
, mientras
t
res plantas control fueron rociadas
, únicamente
,
con
158
agua destilada estéril (Güm
rükcü et al. 2016). Las plantas tratadas se cubrieron con fundas de
159
polietileno por 24 horas para mantener
alta
humedad
y favorecer la infección.
Al día siguiente
,
las
160
plantas regresaron al invernadero donde se mantuvo una temperatura de 23 ± 2 °C y humeda
d relativa
161
alrededor
de 90% (Yu et al. 2014).
El monitoreo del
aparecimiento de los síntomas de la enfermedad
162
fue diario
. Al
presentarse los síntomas típicos
en las hojas de uvilla se reaisló el patógeno en cajas
163
con medio PDA y se realizó la identificació
n molecular
amplificando
la región ITS
mediante
la
164
metodología descrita anteriormente.
165
166
Resultados
167
Identificación y caracterización morfológica de aislados fúngicos
168
Se obtuvieron resultados positivos
de la presencia de
B. cinerea
en
las parcelas
seleccionadas
.
Los
169
síntomas
sospechosos
de moho gris en hojas de uvilla se presentaron como pequeñas lesiones
170
redondas de color marrón con una capa de micelio de color crema y un halo amarillo (
F
igura 1). Del
171
aislamiento y purificación de
las
muestras foliares se obtuvieron
cinco
aislados que presentaron
172
características macroscópicas similares a
B
.
cinerea
. Las colonias
mostraron
un crecimiento óptimo
173
en los dos medios de cultivo probados
. En PDA
presenta
ro
n
crecimiento
micelial
moderado, el
174
m
icelio aéreo con textura esponjosa de color crema en el anverso y coloración gris en el reverso, con
175
una m
é
dula blanquecina en el centro de la caja (
F
igura
1
). Los aislados
OT05
-
03,
OT05
-
08
,
OT05
-
176
10, OT05
-
21
y OT05
-
25 (códigos internos del laboratorio) des
arrollaron conidios
a los 14 días de
177
crecimiento
y
al menos 10 esclerocios de color marrón oscuro
-
negro, de tamaño irregular,
178
organizados al azar.
El aislado
OT05
-
03 no desarrolló esclero
cios en ninguno de los medios de
179
cultivo
. Mientras que
,
en MEA se o
bservaron colonias con crecimiento abundante, micelio aéreo
180
esponjoso de color blanco en el anverso y también coloración blanca en el reverso
. A
los
siete
días se
181
observó la presencia de conidióforos en el micelio
(
Figura 1
). La descripción microscópica me
diante
182
microcultivo permitió observar al menos cinco conidióforos y más de 50 conidios por campo óptico
183
(
F
igura 1).
En general, t
odos los conidióforos se presentaron rectos y ramificados de color marrón
184
oscuro, los cuales contenían los conidios (forma de r
acimo de uvas). Los conidios se presentaron
185
unicelulares, ovoides la mayoría hialinos y otros de color marrón oscuro.
L
os conidios
midieron
de
186
ancho
a partir
6.34 a 9.18 y de largo 5.58 a 8 µm, mientras las medidas de los esclerocios
fueron
187
desde 2.75 a 8.7 de ancho, hasta 3.25 a 6.75 mm de largo.
188
Identificación molecular
189
L
os amplicones obtenidos de la PCR presentaron un tamaño de 500
pb
según la comparación con la
190
escalera de peso molecular y mediante electroforesis en agarosa al 1.5%
. Al
comparar
las secuencias
191
consenso
con
las bases de datos de
l
National Center for Biotechnology Information
(
NCBI
/
192
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
)
y de Mycobank
(
https://www.mycobank.org/
)
, se obtuvo un
193
porcentaje de
cobertura e identidad
del 100
% con el hongo fitopatógeno
Botrytis cinerea
(
Tabla
1
).
194
Postulados de Koch
.
-
Los
cinco
aislados
inoculados
en las plantas de uvilla provocaron
marchitez
195
en las hojas.
La
infección por disco de agar
permitió que
todas las cepas presentar
an
alta
196
patogenicidad, provocando moho gris en el 100
% de las plantas infectadas. En los primeros
siete
197
días se observó clorosis alrededor de las heridas de las hojas, eventualmente
se
desarroll
aron
manchas
198
redondas de color marrón oscuro. A los 14 días
, el micel
io cubrió
las lesiones
y,
a los 18 días se
199
produjo la colonización
total de la hoja con micelio,
lo que resultó en
marchitamiento,
debilidad
200
extrem
a
y muerte
(Figura 1)
.
201
202
Discusión
203
El género
Botrytis
engloba 35 especies, pero la única especie capaz de inf
ectar a una amplia gama de
204
cultivos y causante del moho gris es
B
.
cinerea
(Kozhar y Pe
e
ver 2018).
Del total de muestras
205
analizadas
,
se obtuvieron
cinco
aislados
identificados, molecularmente, como
B
.
cinerea
. Las hojas
206
presentaron lesiones pequeñas
,
redondas
,
de color gris con un borde amarillento (clorosis localizada).
207
Dichos
síntomas foliares del moho gris
,
causados por
B
.
cinerea
en el cultivo de uvilla
,
se diferencian
208
REMCB Formato de modalidad nota científica
5
de los provocados
por otro tipo de hongos
fitopatógeno
s
.
L
as cepas
fúngic
a
s
que
se desarrollaron en
209
medio
PDA presentaron micelio aéreo de color crema con textura esponjosa a los
siete
días
,
y después
210
de 10 días se obtuvieron tonalidades en gris,
con el desarrollo de
esclerocios a las dos semanas de
211
crecimiento
,
similar a lo descrito
por
Leiva
-
Mora et al.
(
2019
),
en
la
investigación
en fresas (
Fragaria
212
vesca
), donde
indican que las colonias del hongo en PDA son de color crema y
,
posteriormente
,
213
cambian a color gris, haciéndose visible la presencia de conidióforos en el micelio. El tam
año de los
214
esclerocios de los aislados obtenidos fue de 2 a 9 mm, resultado que coincidió con los reportados por
215
Erper et al.
(
2015)
quienes obtuvieron medidas de entre 1 y 4 mm por estructura. Los esclerocios son
216
considerados como estructuras importantes
de este hongo, debido a que intervienen en la
217
supervivencia de la especie permitiendo la resistencia del hongo a condiciones ambientales extremas
218
(
Terrones
-
Salgado et. al.
20
19
). Por otra parte, el crecimiento del hongo en
medio
MEA presentó
219
esporulación
abundante, el micelio fue de textura esponjosa de color blanco. Estas características son
220
muy similares a las obtenidas por Stewart y Long (1987), quienes describen que
B
.
cinerea
esporula
221
de manera abundante en MEA y señalan que la cantidad de luz que rec
iben los cultivos no influye en
222
su crecimiento. En consecuencia, al esporular en menor tiempo, la presencia de esclerocios también
223
se identificó antes de las dos semanas. Adicionalmente, este hongo fitopatógeno se caracteriza por
224
crecer de manera óptima en
medios de cultivo que cuenten con un pH ácido
(
Terrones
-
Salgado et. al.
225
20
19
).
En cuanto a los caracteres microscópicos,
todos los aislados presentaron conidióforos rectos y
226
ramificados de color marrón oscuro. Mientras que los conidios se observaron unic
elulares, ovoides
,
227
la mayoría hialinos y otros de color marrón oscuro con un tamaño de entre 6,1 a 9,4 µm de ancho x
228
5,1 a 8,9 µm de largo. Estas características son similares a las presentadas por
Pei et al.
(
2019)
donde
229
los conidios se presentaron hialin
os a marrón oscuro, ovoides con tamaños que van desde 3,9 a 6,1
230
µm de ancho x 6,7 a 13,5 µm de largo (promedio 8,5 x 5,7 µm). Así también, coinciden con las
231
características microscópicas reportadas por
Apolonio
-
Rodríguez et al.
(2017),
donde observaron
232
con
idios unicelulares, ovoides, hialinos con medidas de 8
-
15 µm de ancho x 6
-
9 µm de largo
. Esto
233
permitió identificar
que
,
los conidios de
B
.
cinerea
evaluados
presenta
ron
un rango de tamaño similar.
234
Tradicionalmente, las características morfológicas como
patrón de crecimiento micelial, grado de
235
esporulación, forma de conidios y conidióforos
,
y especificidad del hospedero
, hacen posible
236
distinguir entre las especies de
Botrytis
(Badotti et al. 2017).
Sin embargo, no son suficientes para la
237
identificación de
especie dentro de
este
género
.
En
el
estudio
de
Notte et al.
(
2021)
sobre la
238
identificación y caracterización de
B
.
cinerea
,
se
sugiere el uso de tres genes codificadores de
239
proteínas nucleares (G3PDH, HSP60 y RPB2)
para la identificación de
l
as
especies
. Est
os
análisis se
240
deberían llevar
a cabo
en el caso de que la secuenciación de la región ITS no obtuviera resultados
241
aceptables, lo cual no se presentó en este estud
io, por lo que, se identificó a
los
cinco
aislados fúngicos
242
como
B
.
cinerea
luego de comparaciones
en las bases de datos
mencionadas anteriormente.
243
En cuanto a los postulados de
Koch, se
confirmó que, el hongo aislado es el agente causal de la
244
enfermedad
en
las hojas de
plántulas sanas de uvilla. Estudios demuestran que las vías
de penetración
245
del patógeno se logran por heridas (Catarina 2014).
La
infe
cción por disco de agar logró que los cinco
246
aislados que se utilizaron para
inocular
las plántulas de uvilla produjer
a
n síntomas. Se observaron
247
lesiones pequeñas
circulares
de color
marrón cubiertas de micelio dando el
aspecto de moho gris
. Las
248
lesiones se extendieron rápidamente
sobre
las hojas de las plántulas inoculadas
y
,
eventualmente
,
se
249
presentó
el marchitamiento
general
. Síntomas similares a los reportados en el estudio realiz
ado por
250
Chen
et al.
(2021) donde, los resultados de la prueba de patogenicidad con tampones de micelio en
251
hojas
,
obtuvieron manchas necróticas de color marrón, y en
la
etapa más avanzada de la enfermedad
252
reportaron propagación de las lesiones hasta inducir a la marchitez y defoliación de la
planta
. Wang
253
et al.
(2011) describieron los mismos síntomas utilizando el mismo método de
inoculación
. Al inicio
254
de la infección
,
r
eportaron pequeñas manchas de color marrón, que luego se expandieron aumentando
255
su tamaño
,
siendo visible la presencia de micelio de color gris en las lesiones. Por último, se realizó
256
un re
-
aislamiento del tejido foliar con síntomas para su identificación
y secuenciación, donde se
257
confirmó que el hongo causante del moho gris fue
B
.
cinerea
cumpliendo así con los postulados de
258
Koch
. Dichos hallazgos, resultan comparables con lo obtenido por Terrones
-
Salgado et al. (
20
19).
259
Cabe destacar que, los muestreos se
realizar
on
en seis parcelas
geográficamente distintas
,
y
se aisló
260
REMCB Formato de modalidad nota científica
6
el fitopatógeno únicamente en
l
a parcela ubicada en
los andes septentrionales de Ecuador
261
(
G
uching
u
ero, Otavalo
)
.
Entre los distintos sitios, se evidenció un cambio en el manejo de los cultivos
262
que podría estar ligado a la no presencia de
B. cinerea
. En las parcelas
donde no se aisló
el patógeno
263
en cuestión se identificó la
apli
cación de
buenas prácticas de agricultur
a (BPA)
, entre ellas,
un
264
correcto manejo de desechos
. Esto impide
la formación de estructuras de supervivencia del hongo y
,
265
por ende
,
contaminación del
cultivo (Villasanti y Godoy 2012).
Por otro lado, se ha descrito que,
266
rangos de
humedad situados
entre 9
0 y 100 % favorecen al crecimiento del hongo (Kozha y Peveer
267
2018: Leiva
-
Mora et al. 2019).
Este particular coincide con lo encontrado en la parcela de la que se
268
aisló
B.
cinerea
.
A
diferencia de los demás sitios que no mostraron a simple vista sistemas de
riego
269
implementados. Lo anteriormente descrito, abre la oportunidad de investigaciones que correlacionen
270
y demuestren si las BPA y los distintos porcentajes de humedad inciden o no en la aparición de la
271
enfermedad, severidad e incidencia dentro de un camp
o de uvillas.
272
Este estudio reportó
por primera vez la presencia de
B
.
cinerea
en
tejido foliar de
cultivos de uvilla
273
de la zona norte del Ecuador. Los aislados del fitopatógeno se identificaron mediante análisis
274
fenotípico y molecular. Se confirmó el
agente causal de moho gris mediante postulados de Koch.
L
a
275
información obtenida en este estudio servirá como una herramienta para
próximas investigaciones
276
relacionadas
control biológico o busquen comprender la epidemiología de la enfermedad confirmada
277
en e
l país.
278
279
Agradecimientos
280
La presente investigación fue
financiad
a
por
la Pontificia Universidad Católica del Ecuador,
281
C
onvocatoria
de proyectos de investigación, 2018. El reconocimiento especial a
la empresa
282
TERRAFERTIL por fa
cilitar la logística de los
muestreos y las plántulas de uvilla
para la
283
investigación
.
284
285
Contribuciones de los Autores
286
Renata Lozada
: redacción de la versión inicial del manuscrito, manejo del experimento y adquisición
287
de datos
,
Alexis Quintana
: revisión y edición del manuscrito,
Jeniffer Yánez
: concepción y diseño
288
del estudio
,
y revisión del manuscrito.
289
290
Conflicto de Intereses
291
Los autores declaran no tener conflictos de interés.
292
293
294
295
Referencias
296
297
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Apolonio
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08
-
13
-
0855
-
PDN.
416
REMCB Formato de modalidad nota científica
9
417
418
419
FIGURAS
420
421
422
423
424
425
426
427
428
429
430
431
432
433
434
435
436
437
Figura 1.
A) Hoja de uvilla con mancha
s
de color gris
,
característica de
Botrytis cinerea
en campo
.
438
B) Conidiófor
o con aumento total de 400X. C)
Marchitamiento general
de la hoja
a los
18 días
439
después de la
in
oculación
(postulados de Koch)
.
Colonias de
Botrytis cinerea
después de
siete
días
440
d
e incubación, en PDA, anverso (A1
)
y reverso (B1) y en
MEA, anverso (C1)
y
reverso (D1).
441
442
443
TABLAS
444
445
Tabla 1.
Identificación molecular de l
a
s
cepas fúngicas
aislad
a
s
mediante
coincidencias
de la
446
secuencia de la
región ITS
en
las bases de datos de
GenBank (
NCBI
)
y Mycobank.
447
448
449
450
451
452
453
454
C
epa
Número de
acceso de
referencia
Porcentaje de
cobertura
e identidad
Identidad
OT05
-
03
MK370589.1 (GenBank)
KX229751.1 (Mycobank)
100
Botrytis cinerea
OT05
-
08
MN853356.1 (GenBank)
MG204872.1 (Mycobank)
100
Botrytis cinerea
OT05
-
10
MT422213.1 (GenBank)
KY984483.1
(Mycobank)
100
Botrytis cinerea
OT05
-
21
MT218334.1 (GenBank)
MG560199.1 (Mycobank)
100
Botrytis cinerea
OT05
-
25
MN853683.1 (GenBank)
MG204872.1 (Mycobank)
100
Botrytis cinerea